小鼠出生前后角膜神经分布的变化△

王 存 薛芸霞 杨亚兵 傅 婷 李志杰 夏潮涌

哺乳动物的胎儿经分娩脱离母体成为独立个体，其出生前后的生存环境发生了巨大的改变，如脱离了胎盘和脐带的血液循环、从没有外呼吸到自主外呼吸、生活空间从比较黑暗变为明亮等，这一系列的改变导致机体发生显著的生理变化［1］。成年哺乳动物的角膜神经纤维分布已得到广泛的研究［2-6］，但是，对出生前后小鼠角膜神经变化的研究报道极少，尽管McKenna等［7］观察了C57/BL6小鼠胚胎期和出生后的角膜神经分布，却未对其进行动态的定量分析。为此，本实验使用免疫荧光染色法显示和记录出生前后小鼠完整角膜的所有神经纤维，并对其进行定量分析，以期了解小鼠出生前后角膜神经纤维的长度和密度是否有变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20只C57/BL6小鼠购于中山大学动物实验中心，雌雄随机，均无眼病。按出生前后不同时期将小鼠分为4组:胚胎期17 d(E17 d)组、胚胎期20 d(E20 d)组、出生当天(P0 d)组、出生后3 d(P3 d)组，每组5只小鼠(10只角膜)。实验动物的使用严格遵循国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》。

1.2 取材 断颈法急性处死小鼠后，在奥林巴斯体视显微镜(SZ61，日本)下，将刀片从眼球角膜缘处切入，并穿过对面，先切开一侧，再用维纳斯剪剪开另一侧，成功取下角膜，置于0.1 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，用镊子剥离虹膜和巩膜等角膜周边组织，期间镊子应尽量避免触碰角膜，尤其是角膜上皮，以免损伤角膜神经，影响实验结果。

1.3 免疫荧光染色 按以下步骤对角膜组织进行免疫荧光染色［8］:20 g·L-1多聚甲醛4℃固定1 h，0.1 mmol·L-1PBS 清洗3 次，每次5 min，20 g·L-1牛血清白蛋白和0.1 mmol·L-1PBS混合物(BSAPBS)(捷倍斯，中国)室温封闭15 min，体积分数0.1%Triton X-100(国奥，中国)室温透膜15 min，抗神经元β-微管蛋白Ⅲ抗体(NL557，美国)4℃避光孵育过夜，0.1 mmol·L-1PBS清洗3次，每次5 min。

1.4 角膜分区与角膜整组织铺片 在倒置显微镜下，角膜上皮朝上，用刀片将角膜呈放射状切成4部分:背鼻侧(dorsal nasal side，DN)、背颞侧(dorsal temporal side，DT)、腹鼻侧(ventral nasal side，VN)、腹颞侧(ventral temporal side，VT)，用镊子将角膜组织充分展开(无褶皱)，使角膜能够充分与玻片接触，便于拍照。铺片后加抗荧光淬灭封片液(碧云天，江苏)封片，避光保存。

1.5 拍照和定量分析 使用荧光显微镜(Leica，德国)拍照，观察完整角膜的神经纤维分布，测量其表面积(Image-Pro Plus 5.1软件)。使用DeltaVision Core仪(Applied Precision，美国)对角膜进行扫描成像，每年龄组获约200张图片，计算整个角膜表面积范围内的神经纤维密度和总长度。根据体视学测算线性结构的原理［9］，为降低神经纤维走向的方向性所造成的误差，采用8条水平曲线(长6.94 mm，间距0.53 mm)测试框，计数神经纤维与测试框内水平曲线的交叉点数，计算交叉点数与该框内曲线总长度的比值PL(即交叉点密度)，然后计算每单位角膜表面积的神经纤维长度即角膜神经纤维密度(LA):LA=π/2×PL。完整角膜表面积乘以角膜神经纤维密度即为整个角膜神经纤维总长度。所有计量结果以±s表示，采用SPSS 17.0软件的独立样本t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 小鼠角膜的神经纤维分布 E20 d组的角膜神经纤维分布明显比E17 d组和P0 d组更密集，与P3 d组的疏密程度相似，各年龄组内角膜4个分区间的神经分布无明显差异。角膜基质神经纤维的直径明显大于上皮神经纤维，角膜外周的神经纤维直径明显大于角膜中央，随着年龄的增长，角膜基质神经纤维越来越少(图1)。

2.2 小鼠角膜表面积的变化 E17 d组、E20 d组、P0 d组和P3 d组的角膜表面积分别为(0.34±0.03)mm2、(0.39 ± 0.03)mm2、(0.46 ± 0.06)mm2和(0.51±0.01)mm2，角膜表面积随年龄的增长而逐渐增大，相邻年龄组间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)，但E17 d组和P3 d组、E20 d组和 P3 d组间角膜表面积差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。

2.3 小鼠角膜神经纤维密度与总长度随年龄的变化 角膜神经纤维总长度与神经纤维密度的变化趋势相似，具体见图2。E17 d组和E20 d组的角膜神经纤维密度分别为(9.11±0.65)mm·mm-2和(13.04±1.83)mm·mm-2，差异具有统计学意义(P＜0.01)。而P0 d组的角膜神经纤维密度为(9.02±0.45)mm·mm-2，较 E20 d组减少了30.82%(P＜0.05)。P3 d组的角膜神经纤维密度为(12.87±1.04)mm·mm-2，比 P0 d组增加了42.70%(P＜0.01)，与 E20 d组相似(P＞0.05)。E17 d组、E20 d组、P0 d组和P3 d组的角膜神经纤维总长度分别为(3.10±0.59)mm、(5.09±1.03)mm、(4.15±0.46)mm 和(6.56±1.11)mm。从E17 d组到E20 d组、E20 d组到P0 d组、P0 d组到P3 d组，神经纤维总长度分别增加了64.23%、减少了18.41%、增加了58.20%(均为P＜0.05)。不同年龄组角膜4个分区神经纤维密度见表1。由表1知，角膜各分区神经纤维密度的变化趋势与整个角膜神经纤维密度的变化趋势一致。

Figure 1 Corneal innervation in different age groups(×5).A:E17 d group;B:E20 d group;C:P0 d group;D:P3 d group 不同年龄组小鼠角膜神经纤维分布情况(×5)。A:E17 d组;B:E20 d组;C:P0 d组;D:P3 d组

Figure 2 Changes of corneal nerve fiber density(A)and total length(B)with age increase(Compared with the former age group，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01) 角膜神经纤维密度(A)和总长度(B)随鼠龄的变化曲线(与前一个年龄组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01)

表1 不同年龄组角膜4个分区神经纤维密度情况Table1 Corneal nerve fiber density in four regions in different age groups (Density/mm·mm-2)

3 讨论

哺乳动物的角膜是透明的，无血管分布，具有密集的神经分布，主要包括感觉和自主神经纤维［5］。这些角膜神经纤维对于刺激和疼痛都非常敏感，可保护角膜以及眼部其他部分免受外界环境的伤害。而且角膜神经主要通过释放能够保持上皮稳定的营养物质和激活能够刺激产生泪液和眨眼的脑干回路发挥感觉功能，这对于保持眼表功能的完整性具有重要作用［2］。角膜神经纤维的缺失会导致神经营养性角膜炎，其临床表现为角膜感觉缺失、干燥［2］。因此，研究发育各阶段角膜的神经分布对角膜神经纤维相关疾病的诊断与治疗具有重要意义。但是用于角膜神经发育研究的人眼标本是难以得到的。虽然C57/BL6小鼠的体型明显小于人类，但是它们的眼部结构与人类非常相似，并且二者的基因组有许多相同的区域。因此，本实验选择C57/BL6小鼠作为实验动物。

以往的研究通常使用共聚焦显微镜记录角膜的神经纤维并对其进行定性或定量分析，但是共聚焦显微镜无法记录直径小于0.5 μm的神经纤维［10-13］。因此，本实验使用DeltaVision Core仪显示并记录了角膜上的所有神经纤维，弥补了共聚焦显微镜的这一不足。McKenna等［7］曾报道，角膜的DT分区是最晚发现神经束的。我们前期的研究［14］也证实了在小鼠睁眼前后，角膜神经纤维的发育会受到一定程度的影响，与文献报道不同的是，我们发现DN区神经纤维密度的变化趋势异于其他3个分区(DT、VN和VT区)。因此，本实验分别对角膜4个分区的神经纤维进行了定量分析。结果显示，角膜4个分区不同年龄组间神经纤维密度的变化趋势一致。

本文结果显示，角膜表面积随年龄的增长而逐渐增大，分娩过程和出生前后生存环境的变化并没有对其产生明显的影响，但会使角膜神经纤维密度和总长度明显减少。当新生鼠适应出生后的生存环境后，角膜神经纤维总长度和密度会补偿性增长。分析其原因可能为:(1)分娩过程中产道会对机体挤压从而造成伤害，也可能会挤压或摩擦角膜，角膜上皮具有密集的神经分布，且这些神经纤维易受到损伤，但是这种损伤是可以自动修复的［8］。(2)小鼠生存空间与状态的改变，如出生前主要通过脐带获得母体的营养和排泄代谢产物，没有自主的外呼吸，而新生鼠由母乳摄取营养并有自主的外呼吸。这种改变可能会引起小鼠生理机能等多方面的暂时性改变，包括角膜神经纤维的暂时性减少。(3)光线是视觉系统的动力，而且光线的刺激是视杆细胞光敏感性发育的关键因素之一［15］。光线中的紫外线B(ultra violetray B，UVB)会导致眼部视觉的伤害性改变［16］，而眼表的高紫外线吸收率在一定程度上可保护眼球内部免受UVB的伤害［17］。最近有研究报道，高剂量的UVB直接照射角膜会改变其形态并引起新陈代谢紊乱，甚至导致眼部视觉的伤害性改变［16］，但是，UVB可通过间接机制调控角膜上皮细胞抗氧化剂和促炎症反应因子的表达来调整炎症反应和保护角膜免受UVB诱导的氧化应激的刺激［18］。运用紫外线A/核黄素疗法治疗圆锥角膜时，损伤的角膜神经纤维随后可以再生［19］，还有报道，光线会改变三叉神经的活力［20］。显然，光线尤其是紫外线会对角膜及其上的神经纤维产生一定的影响。尽管新生小鼠并未睁眼，但是小鼠的眼睑很薄，出生后的光线强度明显大于出生前，也可能会对角膜上皮神经纤维造成损伤。本文结果提示，如果人出生前后角膜神经纤维的发育也存在与小鼠类似的情况(即新生儿的角膜神经纤维密度与总长度低于出生前，随后追赶性增长)，那么这无疑会为人角膜神经纤维的研究提供一个思路。

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