U251胶质瘤细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

陈 成芦 明李茗初方加胜

U251胶质瘤细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

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目的本研究旨在从U251胶质瘤细胞系中分离、培养和鉴定脑肿瘤干细胞，观察其的生长特征，为脑肿瘤干细胞的进一步研究打下基础。方法应用简化的无血清培养基和悬浮培养法培养U251细胞，并将获得的脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基中观察其分化；交替用含血清培基和无血清培基培养U251细胞，观察其生长特性；用免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞中CD133和Nestin的表达。结果U251细胞接种至无血清培养基后，部分细胞能够存活并增殖为悬浮生长细胞球，并具有很强的自我更新和增殖能力；这种悬浮生长的细胞转移到含血清培基中后可贴壁分化；U251细胞在含血清培基和无血清培基中交替培养时能够快速转换生长方式；脑肿瘤干细胞中CD133和Nestin表达阳性。结论U251胶质瘤细胞系中含一定比例脑肿瘤干细胞，此种细胞可在体外分离，培养和诱导分化。脑肿瘤干细胞的发现可能将为脑肿瘤研究提供全新的思路。

U251胶质瘤细胞系；脑肿瘤干细胞；分离培养；分化

Singh和Hemmati等分别报道了利用含特殊成分的无血清培养基从神经上皮来源脑肿瘤中分离出具有神经干细胞（Neural Stem Cell，NSC）性质的肿瘤细胞，并证实其为脑肿瘤干细胞（Brain Tumor Stem Cell，BTSC）[1,2]。U251细胞系（U251 glioma cell line）是一种应用广泛神经胶质细胞来源的，较成熟的肿瘤模型。本实验中，我们用简化的无血清培基悬浮培养法培养U251细胞，从中分离培养脑肿瘤干细胞，观察其形成脑肿瘤干细胞球（Brain Tumor Sphere，BTS），及脑肿瘤干细胞的增殖、分化等生长特性，检测神经干细胞相关标志物CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞中的表达，为脑肿瘤干细胞的进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1细胞系和细胞培养基U251细胞系由中南大学肿瘤研究所惠赠。特级胎牛血清（Hyclone）、DMEN/F12（1:1）培养基（Gibco）、B27添加剂（Gibco）、重组人表皮生长因子（EGF,PeproTech）、重组人碱性成纤维生长因子（bFGF,PeproTech）。配制成10%的含血清培基和含EGF（20ug/L）、bFGF（20ug/L）、2%B27的无血清培基。

1.2检测试剂小鼠抗人 CD133单克隆抗体（R&D System），小鼠抗人 Nestin单克隆抗体（Chemicon），FITC标记山羊抗小鼠IgG（Boster），Cy3标记绵羊抗小鼠IgG（Sigma）。

1.3细胞培养及传代将U251细胞接种于培养瓶中，用10%的含血清培基贴壁培养，每48小时按1:3的比例传代一次，使之大量扩增。取处于对数生长期的细胞，用D－Hanks液漂洗两遍后，0.25%胰酶消化，自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞悬液，洗去胰酶重悬于无血清培基。台盼兰染色并用计数板计数，调整成5×105/孔接种于6孔板，在37℃，5%CO2培养箱中悬浮培养。增殖形成肿瘤干细胞球后，将其收集并机械吹打，在保存细胞活力的前提下尽量将肿瘤干细胞球吹散，重悬于无血清培基，按1:2比例传代于6孔板。

1.4肿瘤干细胞的诱导分化取性状稳定的第3、4、5代的肿瘤干细胞球，反复吸打成细胞悬液，用D－Hanks液漂洗两遍后，直接接种到 10%的含血清培基中，肿瘤干细胞球完全转变成单层贴壁细胞并增殖后，按1:3的比例传代。

1.5 U251细胞在无血清和含血清培基中交替培养，肿瘤干细胞的冻存和复苏按1.3所示的方法在无血清培基中培养出典型的肿瘤干细胞球后，按1.4所示的方法接种到含血清培基并传代一次后，再按1.3所示方法接种到无血清培基。如此在无血清和含血清培基中交替培养，重复3次。

取处于对数生长期的含血清培基贴壁培养的U251细胞，用以无血清培基配制的含10%DMSO的冻存液保存细胞于液氮中。一个月后常规方法复苏，无血清培基重悬细胞，按1.3所示方法悬浮培养。取肿瘤干细胞球反复吹打成细胞悬液后冻存、复苏、再培养，方法及材料同血清培基贴壁培养的U251细胞。

1.6肿瘤干细胞球的免疫组化取培养到第5代的肿瘤干细胞球及其反复吹打后的细胞悬液，离心后滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，静置待干，4%多聚甲醛固定，正常血清封闭（对Nestin染色尚需在此之前用 0.4%Triton X-100处理标本30min），抗CD133或抗Nestin一抗孵育4℃过夜，Cy3或FITC标记二抗避光孵育37℃30min，每步骤间均用0.01M PBS冲洗3遍。封片后置荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1肿瘤干细胞球的形成将U251细胞接种至无血清培基，2h后倒置相差显微镜观察，大部分细胞悬浮生长，但仍有部分细胞贴壁并长出突起，见图1A。24h后部分孔中可见肿瘤干细胞球，第三天贴壁细胞仍较多，贴壁细胞有不规则突起，但增殖不明显；此时各孔明显可见肿瘤干细胞球生成，部分肿瘤干细胞球表层细胞长出突起并贴附培养板底壁，见图1B。本实验室采用相似方法和培基培养的人胚胎神经干细胞球没有这种现象。传代后肿瘤干细胞球增殖较迅速，且贴壁细胞和贴壁的肿瘤干细胞球均明显减少，见图1C。培养到第三代，培养板中几乎无贴壁细胞，肿瘤干细胞球呈典型的球形，边缘规则无突起，折光性好，细胞间连接较紧密，见图1D。第三代后肿瘤干细胞球增殖速度，形态等都较稳定。约72h传代一次，如培养超过5d，肿瘤干细胞球大多停止生长，折光性下降，并可见肿瘤干细胞球周围有絮状物生成。

图1 U251细胞在无血清培基中的生长情况及其与神经干细胞的比较

2.2诱导分化吹打成细胞悬液的脑肿瘤干细胞转移到含血清培基中后表现出很强的贴壁能力，2h内绝大部分细胞开始贴壁，细胞形态及增殖性与原始的U251细胞相似。

肿瘤干细胞球转移到含血清培基中后，4h内可见几乎所有的肿瘤干细胞球贴附培养板底壁，见图2A；随后肿瘤干细胞球变扁，培养细胞从肿瘤干细胞球中迁移出来，向四周爬行生长，见图2B。48h内绝大部分肿瘤干细胞球完全转变成单层贴壁细胞，均较本实验室相同条件下培养的神经干细胞球明显迅速。

图2 脑肿瘤干细胞球在含血清培基中的表现

2.3 U251细胞的反复贴壁和悬浮培养及肿瘤干细胞的冻存和复苏U251细胞在含血清培基中呈贴壁生长，而在无血清培基中呈悬浮状态生长并形成脑肿瘤干细胞球，且都能在相应的培养基中连续传代。更换培养基后U251细胞的生长方式很快发生转换，重复几次后这种转换能力并不减弱。

贴壁培养的U251细胞经冻存、复苏后仍能顺利的分离培养脑肿瘤干细胞，且其生成脑肿瘤干细胞球的能力未见减弱。肿瘤干细胞球吹打成的细胞悬液经冻存、复苏、再培养后，细胞成球数量减少，增殖缓慢。考虑可能与反复吹打导致细胞活力下降，及将脑肿瘤干细胞球吹成单细胞悬液较困难，而未吹散的残存肿瘤干细胞球直接冻存后复苏困难，大部分不能存活等因素有关。

2.4未分化的脑肿瘤干细胞能表达CD133和Nestin 本实验中从 U251细胞中分离培养的脑肿瘤干细胞球中的脑肿瘤干细胞，及吹打后散在的单个未分化脑肿瘤干细胞均呈CD133和Nestin染色阳性，见图3。

图3 脑肿瘤干细胞表达神经干细胞特异性标志物CD133和Nestin

3 讨论

干细胞（Stem cell,SC）是一类具有自我更新能力并通过自我更新获得永生化且具有分化潜能的细胞。人们同时也注意到，肿瘤无限增殖特性与正常干细胞相似。那么肿瘤中是否存在某种具有干细胞相似性质的细胞，是否正是它们在主导着肿瘤的发生、增殖、转移和复发？肿瘤细胞是否就是源于正常干细胞的变异？迅速发展的干细胞理论能否帮助我们在长期困扰人类的肿瘤起源问题上取得突破？

近年来，研究者在血液和乳腺肿瘤干细胞的理论和实验研究方面取得的一些进展向我们揭示了实体肿瘤干细胞存在的可能性[3-5]。2003年，Singh和Hemmati各自独立证明了神经上皮来源脑肿瘤中存在干细胞性质的肿瘤细胞[1-2]。本研究中，我们从U251细胞中分离出脑肿瘤干细胞，并连续传代，观察其形成脑肿瘤干细胞球的能力和分化能力；用免疫荧光法证实神经干细胞相关标志物 CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞中的表达。

脑肿瘤干细胞是一个较新的概念，其起源并不确切，脑肿瘤干细胞有自我更新、分化等能力，提示着它们可能来源于正常的神经干细胞。而脑肿瘤干细胞与正常神经干细胞有着相似的标志物，也从一个侧面支持了肿瘤干细胞来源于正常的干细胞[1,2,6]。Recht和Seyfried从基因突变的角度也提出NSC有可能是脑肿瘤干细胞的起源细胞，并在神经系统肿瘤发生的最初阶段起着重要的作用[7,8]。

脑肿瘤干细胞理论指出脑肿瘤可能由少数脑肿瘤干细胞通过不断的自我更新和增殖、分化而来[1,9]。我们在实验中观察到只有少数的细胞能在悬浮状态下长期存活并生成脑肿瘤干细胞球，这些细胞即脑肿瘤干细胞。这些脑肿瘤干细胞可持续传代，细胞数量不断扩增，在一定条件下能分化为单层贴壁细胞并与原始U251细胞相似。以上实验现象也符合脑肿瘤起源于脑肿瘤干细胞的观点。

脑肿瘤干细胞理论的提出和脑肿瘤干细胞的分离，培养及鉴定均具有重要意义。首先，脑肿瘤干细胞理论为脑肿瘤的来源，脑肿瘤的增殖、转移和复发等研究提供了全新的思路；其次，脑肿瘤干细胞可成为脑肿瘤基础研究的重要材料，进而有可能提出新的治疗理论，发现新的治疗药物和方法；最后，由于脑肿瘤干细胞与神经干细胞的相似性，可以预见二者的研究必将相互促进，特别是神经干细胞相关的一些成熟的理论将在脑肿瘤研究领域引发新的思考。

[1]Singh SK,Clarke ID,Terasaki M,et al.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J].Cancer Res,2003,63(18): 5821-5828.

[2]Hemmati HD,Nakano I,Lazareff JA,et al.Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(25):15178-15183.

[3]Bonnet D,Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nat Med,1997,3(7):730-737.

[4]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[5]Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad SciUSA,2003,100(7):3983-3988.

[6]Berger F,Gay E,Pelletier L,et al.Development of gliomas: potential role of asymmetrical cell division of neural stem cells[J].Lancet Oncol,2004,5(8):511–514.

[7]Recht L,Jang T,Savarese T,et al.Neural stem cells and neuro-oncology: Quo vadis?[J].JCell Biochem,2003,88(1):11-19.

[8]Seyfried TN.Perspectives on brain tumor formation involving macrophages,glia,and neural stem cells[J].Perspect Biol Med,2001,44(2):263-82.

[9]Singh SK,Clarke ID,Hide D,et al.Cancer stem cells in nervous system tumors [J].Oncogene,2004,23(43):7267-7273.

Isolation,Culture and Identification of Brain Tumor Stem Cellswithin U251 Glioma Cell Line In Vitro

Chen Cheng Lu Ming Li Mingchu Fang Jiasheng

ObjectiveThis study was to isolate,culture and identificate brain tumor stem cells from U251 Gliome cell line in vitro and observe their growth pattern.To establish a fundation for further reseach of brain tumor stem cell.MethodsU251cells were seeded in serum-free DMEM-F12 medium supplemented with B27,EGF and bFGF in 6-well plates,after U251 brain tumor spheres formed,they were dissociated and passaged in fresh medium periodically.U251 brain tumor spheres and the single cells of them were induced to differentiate in the medium with 10% FBS supplemented.U251cells cultivate in serum-supplemented medium and serum-free medium alternately.At last we performed immunocytochemistry of U251 brain tumor spheres for CD133 and Nestin.ResultsSome U251 glioma cell have the capacity to self-renew,proliferate and generate free-floating neurosphere-like brain tumor spheres in serum-free medium in vitro.U251 glioma spheres and the single cells of them can be induced to differentiate and adherent to the bottom of the culture plates.The growing patterns of U251 glioma cell line can be converted by changing the culture mediums.The brain tumor stem cell are CD133+Nestin+ cells.ConclusionThe U251 glioma cell line contain brain tumor stem cells which can be isolated,proliferated and differentiated in vitro.The research of brain tumor stem cells may provide a new platform for brain tumor study.

U251 glioma cell line; Brain tumor stem cell; Isolation; Cell differentiation

1 深圳市人民医院神经外科，广东深圳 518020

2 杭州市萧山区第一人民医院神经外科，浙江杭州 311200

3 北京市宣武医院神经外科，北京 100053

4 中南大学湘雅医院神经外科，湖南长沙 410008