分子标记技术在西花蓟马研究中的应用进展

段惠生 张安盛 李丽莉 门兴元 张思聪 周仙红 于毅

摘要：西花蓟马是一种危险性较强的外来入侵害虫，对我国的农业经济以及生物多样性都造成了极大的损失和威胁。本文概述了分子标记技术在西花蓟马的种类鉴定、种群分化、原产地、传播模式、检测其捕食天敌的效能和携带番茄斑萎病毒(TSWV)等方面的应用，并做了前景展望。

关键词：西花蓟马；分子标记；种类鉴定；种群分化；传播模式；TSWV

中图分类号：S433.89文献标识号：A文章编号：1001-4942(2012)01-0099-05

西花蓟马(Frankliniella occidentalis)属缨翅目(Thysanoptera)、蓟马科(Thripidae)，是一种世界性入侵害虫。该虫原产于美国西部地区，自20世纪80年代后，迅速向外扩散，2003年首次在北京发现，目前该虫分布遍及全球各大洲。在我国。北京、云南、浙江、山东、贵州和江苏等省市都已有分布和为害的相关报道。西花蓟马具有极端多食性，不仅本身对农作物危害极大，并且还可以传播番茄斑萎病毒属(Tospovirus)等多属的植物病毒，造成更严重的损失。西花蓟马不仅对世界经济造成了极大损失，而且对入侵地的生物多样性构成了巨大的威胁，因此各国学者对其早已展开了多方面深入的研究。从20世纪80年代开始，由于分子生物学的飞速发展，出现了多种多样的分子标记技术。分子遗传标记突破了表达型标记的局限性，其变异只来源于基因DNA序列的差异，具有稳定性高、受环境条件的影响较小、信息含量高、不同层次和类群之间广泛可比等优越性，因而成为遗传标记中又一强有力的工具，在揭示物种的遗传变异性研究中发挥着独特的优势。分子标记的发展对西花蓟马的研究提供了强有力的技术支持。

分子标记技术目前已出现了几十种，新的分子标记还会不断涌现。昆虫研究常用的一些分子标记方法有，以Southern杂交为基础的限制性内切酶酶切片段长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)和DNA指纹谱；以PCR为基础的随机扩增片段长度多态性(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、DNA扩增指纹分析(DNA amplification fingerprinting，DAF)、重复序列引物扩增(simple repeat sequence primer-PCR，SRSP-PCR)、扩增片段长度多态性(ampli-fied fragmemt length polymorphism，AFLP)、单链构象多态性PCR(single-strand conformation poly-morphism-PCR，SSCP-PCR)；以重复序列为基础的简单重复序列即微卫星DNA标记(simplesequence repeat，SSR)；以mRNA为基础的mRNA差别显示反转录PCR(mRNA differential displayreverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)、DNA测序(DNA sequencing)以及单核苷酸多态性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)。本文概述了分子标记技术在西花蓟马研究中的应用情况，并对其应用前景做了展望。

1.分子标记在西花蓟马研究中的应用

1.1西花蓟马分子鉴定的研究

西花蓟马是一种危险性较强的外来人侵害虫，对于它的鉴定和分类工作显得尤为重要。西花蓟马的成虫在形态上具有明显的特征，在显微镜下可以将其与其它近似种区别，但对于一些残体、幼虫以及无法从形态上辨别的虫体，利用分子标记技术可以准确、快速地鉴定。国内外学者在这方面已经做了大量的工作。Moritz等(2000)采用内转录间隔区(internal transcribedspacer，ITS)——限制片段长度多态性(ITS-RFLP)的方法，成功地将西花蓟马和美棘蓟马(Echinothrips americanus Morgan)区分开；Toda和Komazaki(2002)采用ITS2-RFLP法鉴别日本果树上常见的9种蓟马(包括西花蓟马)的成虫和幼虫；Brunner等(2002)根据mtCO I-433bp的扩增产物，结合测序和扩增产物RFLP分析，有效区分了西花蓟马、烟蓟马(Thrips tabaciLindeman)和棕榈蓟马(Thrips palmi Karny)；林峻贤等(2003)则基于28S rDNA和16S rDNA探讨Multiplex-PCR及PCR-RFLP鉴定西花蓟马和烟蓟马的可行性。采用PCR产物直接测序法，游中华等(2007)对包括西花蓟马在内的9种蓟马的mtDNA CO I基因片段(433bp)进行了序列分析，准确地检测了各虫态的西花蓟马。

在田间的防治和检验检疫部门日常工作中时常会遇到有多种蓟马的样本，这就需要用种特异PCR检测(species-Specific PCR，SSP)。它是利用序列信息已知的DNA片段设计种特异引物进而鉴定蓟马种类。例如周力兵等(2007)利用Brunner等设计的简并引物mtDNA-7.2F和mtDNA-9.2R扩增出了6种蓟马的mtDNA CO I基因片段，并且设计了西花蓟马特异性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，该两对引物能够将西花蓟马的成虫、幼虫、蛹同花蓟马(Fran-kliniella intonsa)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、八节黄蓟马(Thrips flavidulus)、烟蓟马(Thripstabaci Lindeman)和大蓟马(Megalurothrips distal-is)5种蓟马区分。游中华(2008)通过对西花蓟马近缘种的15种蓟马的ITS2序列分析对比，设计了一对西花蓟马特异性引物YW-ITS2-F和YW-ITS2-F，该引物可以准确地将西花蓟马与其它十几种蓟马区分。孟祥钦等(2010)采用特征序列扩增区域(SCAR)标记技术获得了对西花蓟马具有特异扩增效果的引物1对(FOMF/FOMR)，该对引物不仅对不同虫态的西花蓟马具有扩增能力，而且在西花蓟马发生地的寄主植物组织内亦检测到了其卵的存在。

由此可见，mtDNA CO I和rDNA ITS2基因序列是国内外学者常用于研究西花蓟马分子鉴定的两种分子标记，这两种分子标记都有一定的保守性，又具有适当的变异度，同时运用这两种标记的分子鉴定技术已经十分成熟，操作简单，鉴定速度快，而且准确，因此得到广泛的研究应用。

1.2西花蓟马种群分化的研究

种群分化是指同一生物群体在不同的生存环境条件下，经过长期的进化，彼此之间出现了形态

上、行为上和生理上甚至遗传上不同程度的差异，这种差异或大或小，表现为彼此遗传关系的远近。种群的分化，在更多的情况下，是潜在的遗传差异，为进一步的分化提供着遗传多样性的基础。对于外来入侵害虫种群，如若在入侵地产生明显的种群分化，那么将有可能导致该入侵害虫的大暴发。研究种群内遗传变异、种群间遗传分化的过程及程度，对于理解物种的进化趋势以及种群动态规律具有基础性的意义，进而对入侵害虫的治理起到重要指导作用。

目前，利用各种分子标记技术来研究昆虫种群遗传分化已经成为昆虫生态学研究的热点问题之一。武晓云等(2009)利用PCR技术克隆并分析了西花蓟马的rDNA ITS2和mtCO I基因5'末端的部分序列。结果发现，由于rDNA ITS2变异程度较mtCO I基因大，因此mtCO I基因较rDNA ITS2更适合于西花蓟马的种内遗传分析；入侵我国的西花蓟马可能是由两个(或多个)株系或隐存种组成的复合体，并推测入侵我国的西花蓟马以温室系(greenhouse strain)为主体，也存在一定数量的羽扇豆系(lupin strain)。Brunner等(2010)利用mtCO I基因和微卫星分子标记(SSR)技术对美国西部地区西花蓟马种群进行种群遗传结构分析，结果表明在起源地西花蓟马种群发生了分化，发现这种遗传分化与形态上的分化并不一致，并且讨论了该地区的种群分化是由栖息地的环境不同(地理隔离)造成的。

用于该方面研究的分子标记技术从先前的用mtCO I、rDNA ITS1、rDNA ITS2基因序列分析，到目前广泛使用的SSR技术，两种技术相互补充，能够得到较为全面的结果。例如对我国的烟粉虱、美国白蛾以及苹果绵蚜的研究。

1.3西花蓟马原产地及其传播模式分析

西花蓟马原产于美国西部地区，后来随着各国花卉业不断发展，国际间贸易的频繁逐步扩散到世界各国。2000年，在我国昆明国际花卉节参展的缅甸盆景上首次截获西花蓟马。目前我国的多个省份已经发现了西花蓟马，对我国的经济造成了一定的损失，对我国本土的生物多样性也产生了威胁。研究我国西花蓟马的原产地及其传播模式，对于重新构建西花蓟马的入侵过程，及时寻找并引进天敌，了解入侵初始种群大小及频率，阐明生物在入侵过程中或入侵后的生物学变化，预测入侵物种的生物学特性以及借鉴有效的防治措施等具有重要的意义。

对于入侵种的原产地及其传播模式的研究，传统的形态学无法做出准确判断，而利用先进的分子生物学技术，使这一入侵生态学问题得到有效地解决。将我国的西花蓟马种群与国外各地区的种群进行分子遗传分化的对比分析，计算种群之间的遗传距离，从而判断亲缘关系的远近。这方面运用较多且研究较为成功的分子标记技术是利用mtCO I基因和rDNA ITS2基因序列，例如，武晓云等(2009)采用mtCO I基因序列建树分析云南、北京和哈尔滨的西花蓟马，推断云南是西花蓟马最早入侵的地点，并且推测3个地区的西花蓟马可能是有相似的入侵来源。国内也有成功运用mtCO I分析种群分化的例子，如褚栋等(2005)基于mtDNA CO I对我国烟粉虱种群与国外烟粉虱种群进行序列分析和构建系统发育树，结果表明，我国广大地区暴发成灾的烟粉虱为B型烟粉虱，与美国西部地区以及以色列的烟粉虱具有极高的同源性；首次发现Q型烟粉虱入侵我国，而发现的Q型烟粉虱与西班牙、摩洛哥的Q型烟粉虱有极高同源性。

目前对于西花蓟马种群遗传分析，国内外学者多采用，mtCO I和rDNA ITS2基因序列这两种手段，但由于这两种分子标记相对保守，适合于分析遗传分化较大的生物型或地理种群，对于研究更详细的原产地分析则需要多态性更高的分子标记，如SSR标记。

1.4西花蓟马天敌的研究

目前西花蓟马仅在我国局部地区分布危害，而且由于其抗药性强，利用本土天敌进行生物防治是一项有效的措施。目前，西花蓟马的捕食性天敌种类有30余种。国外利用且取得显著成效的主要包括半翅目的蝽科和捕食螨。捕食性天敌对西花蓟马的控制效能是不一样的，选择出控制效能高的捕食陛天敌对于今后生物防治将起到关键性作用。

对于捕食者—猎物关系的研究，传统的形态学方法有多种，但却有着部分捕食现象观察难度大、室内难以重建田间植被结构和微环境、难以考虑多种因素的交互作用等局限性，随着分子生物学技术的发展，这方面的研究技术也就从形态学水平发展到了分子水平。利用分子标记技术能够灵敏而特异地检测捕食者体内猎物残体，从而准确反映出捕食者对西花蓟马的捕食能力的大小。此方面研究应用的分子生物学技术主要为两类：一类是以蛋白质为研究对象的血清学抗体技术，一类是以DNA为研究对象的分子标记技术。前者常用的分子技术有聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、多克隆抗体免疫检测、酶联免疫吸附法、单克隆抗体技术；，后者常用的有RAPD、RFLP、SCAR、微卫星标记技术、DNA序列中的mtCO I、mtCOⅡ、rDNA ITS2以及实时荧光定量PCR技术。

实时荧光定量PCR技术是在常规PCR的体系内加入荧光染料或带有荧光染料标记的探针，荧光信号随着目的DNA的扩增而增强，通过检测信号判断目的DNA的数量，进而鉴定标本是否为靶标种类，如棕榈蓟马、烟蓟马等。孟祥钦(2010)选取mtCO I为标靶DNA，利用TaqMan实时荧光定量PCR法检测了9种西花蓟马的捕食性天敌，结果表明，捕食性天敌中东亚小花蝽的瞬时捕食能力最强，而异色瓢虫的捕食能力最低，同时该实验利用CO I和SCAR分子标记技术建立了本地天敌对西花蓟马捕食作用的定性检测技术。

分子标记在此方面的研究也是有缺陷的，它不能区分捕食与腐食、二级捕食，因此形态学方法同分子生物学方法应结合运用，发挥各自的优点，从而使得西花蓟马天敌的研究能够得到长足发展。

1.5西花蓟马体内番茄斑萎病毒(TSWV)的检测

番茄斑萎病毒((Tomato spotted wilt virus，TSWV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒，其传播介体为蓟马。蓟马由若虫在病株上取食获毒，成虫不能获毒，但能够专一性地以持久性的方式传播，即蓟马一旦获毒终身能够传毒。西花蓟马是番茄斑萎病毒最主要也是最有效的传播介体。近年来，随着西花蓟马的不断扩散，番茄斑萎病毒也在全世界不断地扩散传播，造成世界农业经济损失不断加重。因此，各国学者逐步重视对西花蓟马携带的番茄斑萎病毒的研究。虽然西花蓟马是番茄斑萎病毒最主要的传播介体，但并不是每个西花蓟马个体中都携带有番茄斑萎病毒，因此检测某地区的西花蓟马体内是否有番茄斑萎病毒显得尤为关键。

检测蓟马体内的番茄斑萎病毒的方法有很多，像ELISA、电镜观察、核酸圆点印迹法以及免疫压片印迹法。但这些方法在处理高通量的样本时都存在不同的缺陷，电镜观察过于耗费时间，ELISA因为没有结构性蛋白而灵敏度较差，免疫压片印迹法在问题的解释上有一定的困难；除此之外，在ELISA和免疫压片印迹法都会产生假阳性现象。

TaqMan实时荧光定量PCR(RT-PCR)是常用于检测蓟马体内病毒的分子标记技术，它免去了PCR后续的检测步骤，缩短了操作时间，显著降低了PCR后操作污染的可能性，而且灵敏度更高，可以更加快速、高通量的检测样品，同时由于它是定量的，能够检测病毒与蓟马间的交互作用。Boonham以西花蓟马的核RNA为标靶，初步探讨了利用实时荧光RT-PCR探针检测西花蓟马体内是否携带番茄斑萎病毒的可能性，结果表明，这种方法不仅可以检测单头的个体，同时也适合应用于大通量的样品检测。

2.小结与展望

从上述事例来看，目前分子标记技术以其灵敏、快速、准确的特点广泛应用在西花蓟马的研究中，极大地扩展了西花蓟马研究领域，丰富了研究手段。分子标记技术种类繁多，而且每种技术本身都有优缺点，因此在应用的同时应该综合利弊，选取合适的标记技术，以达到灵敏而准确的目的，以免造成不必要的浪费。

西花蓟马是一种危险性外来入侵害虫，它的入侵机制、传播模式等人侵生态学问题是需要我们重点关注的。利用分子生物学技术来研究西花蓟马的生物适应、竞争等成功入侵因素，成为未来我们研究西花蓟马的重点和难点，也是一个重要的突破口。国外对西花蓟马的研究起步早，研究范围广，但我国对西花蓟马的研究起步较晚，最早的报道始于2000年。为防止西花蓟马对我国经济造成的损失不断加剧，我们在继续深入地研究西花蓟马的同时，不断地开发新的技术手段，从而更好地为将来的研究服务。烟粉虱也是一种世界性的入侵害虫，对全球经济造成过重大损失，目前各国对其研究已经十分深入而卓有成效，从其生物学特性研究到入侵生态学研究，分子标记技术起到了关键性作用。对于西花蓟马的研究，笔者认为可以以烟粉虱研究为模板，结合西花蓟马本身特性以及相关的分子标记，继续深入展开研究。