核因子κB在烧伤血清诱导血管内皮细胞损伤中的作用

杨喜明,李明

[摘要]目的：探讨核因子κB在烧伤血清诱导血管内皮细胞损伤中的作用。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，随机分为空白对照组、20%（V/V）人烧伤血清刺激组、PDTC预处理组, 1h后采用MTT及流式细胞仪观察HUVECs损伤情况，蛋白印迹法检测HUVECs胞核NF-κB-p65的蛋白表达变化。结果：与空白对照组比较，烧伤血清诱导了HUVECs损伤和凋亡，胞核NF-κB-p65蛋白表达增多。相对于烧伤血清刺激组，PDTC预处理组HUVECs损伤减轻，细胞凋亡显著减少。结论：核因子κB参与烧伤血清致内皮细胞损伤, 阻断核因子κB可能对防治严重烧伤所致的内皮细胞损伤具有一定潜在价值。

[关键词]烧伤；内皮细胞；核因子κB

[中图分类号]R644Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）01-0066-02

NF-κB imvolved in the process of vascular endothelial cells damage caused by burn sera

YANG Xi-ming,LI Ming

(Department of Burn,Affiliated Hospital,Yan'an University,Yan'an 716000, Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the role of NF-κB in the vascular endothelial cells damage by burn sera.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in vitro and randomly divided into 3 groups: 5% fetal bovine serum group; 20% burn human serum group and pretreated with PDTC group. The injury and apoptosis of HUVECs were observed after 1 hours by MTT and flow cytometry. Meanwhile, the content of NF-κB-p65 in the nucleus were detected by wester blotting.ResultsCompared with the 5% fetal bovine serum group, burn serum could induce the injury and apoptosi of HUVECs, up-regulate the protein expressions of NF-κB-p65 in the nucleus. Compared with the 20% burn human serum group, the injury and apoptosis of HUVECs was significantly improved in pretreated with PDTC group.ConclusionsNF-κB is involved in the procedure of HUVECs damage caused by burn serum. It may benefit the HUVECs by blocking NF-κB in severe burn patients.

Key words:burn;endothelial cell;NF-κB

严重烧伤早期血管内皮细胞损伤，不仅造成血管内皮结构的损害，还严重消弱了内皮细胞在调节血管张力、抑制血小板黏附和聚集、抑制血管平滑肌增殖、维持机体凝血纤溶系统平衡及维持血管通透性等方面发挥的重要作用，从而成为烧伤早期休克发生和多脏器受累的基础[1]。核因子κB广泛参与多种细胞的生理、病理过程, 许多研究提示核因子κB参与多种心血管事件[2]，因此深入探讨核因子κB在烧伤血清诱导血管内皮细胞损伤中的作用对于研究烧伤早期抗休克及多脏器保护具有重要意义。

1材料和方法

1.1材料：胰岛素（丹麦 Novo Nordisk公司）；内皮细胞专用培养基（美国 Sciencell公司）；NF-κB-p65(美国 Cell Signaling公司)； 兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗（北京 中衫金桥公司）；核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(南京 凯基公司)；NF-κB特异抑制剂 PDTC（美国 Sigma公司）；Western-Blot系统（美国 Bio-Rad公司）；ChemiDoc XRS凝胶成像分析系统（美国 Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养及实验分组

1.2.1人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的分离培养：在知情同意下获得健康产妇剖宫产后的新鲜脐带（离体时间≤6h），长度约20cm。磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS)灌洗脐静脉至流出液清亮后将1%Ⅱ型胶原酶注入静脉腔，37℃孵育15min，收集消化液，离心沉淀细胞。用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基于37℃、体积分数为5%的CO2和95%的O2条件下培养，每3～5天传代一次，第3～5代细胞用于实验。采用镜下形态观察及Ⅷ因子免疫组化染色对HUVECs进行鉴定。

1.2.2 烧伤血清收集：在知情同意下选择笔者单位烧伤患者9例（男8、女l例），年龄l8～50岁，烧伤面积≥50%（其中Ⅲ度面积≥30%TBSA）。抽取伤后正规抗休克治疗前24 h之内静脉血各10ml，低温离心取上清。

1.2.3 实验分组：按照随机数字表法将实验分为3组：（A）空白对照组：不加任何刺激因素常规培养；（B）烧伤血清刺激组: 用含20%（V/V）烧伤血清的培养液培养；（C）PDTC预处理组:于培养基中加入核因子κB特异抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (PDTC,50mmol/L)预处理 30min后, 施加烧伤血清刺激。各组孵育1h后检测各项指标。

1.3 检测指标

1.3.1 MTT法检测细胞活力：细胞接种于96孔板，烧伤血清刺激1h，按培养基的1/10比例加入 MTT(5mg/ml),37℃继续孵育4h，终止培养，吸弃上清。加入定量二甲亚砜, 振荡10min，使结晶充分溶解。490nm波长分光光度计测定两组OD490值(空白对照为不加细胞只加培养液，空白孔调零)。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率：弃去培养液，用0.125% 胰酶消化，离心收集细胞，无血清培养基制备单细胞悬液（5×105个/ml）后行膜联蛋白V/碘化丙啶（annexin V/PI）双染，于流式细胞仪上采用15mW 氩离子激光，激发光波长为488nm，发射波长为530nm，行定量分析，计算annexin V/PI双染阳性细胞百分含量。

1.3.3 蛋白印迹法（Western-Blot）检测相关分子蛋白表达水平：弃去培养液，用0.125% 胰酶消化，离心收集细胞，按试剂盒步骤依次提取细胞浆和细胞核蛋白, 4，4′-二羧酸-2，2′-二喹啉法测定细胞总蛋白浓度。取等量样本行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜、封闭，将膜与一抗在4℃共同孵育过夜，漂洗后与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育，在暗室中化学发光后经凝胶成像系统扫描并分析。

1.4统计学处理：采用SPSS10.0统计软件处理数据，数据以 x±s表示，均数比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 细胞培养及鉴定 传代后脐静脉内皮细胞24h内全部贴壁,细胞呈多角形或鹅卵石状，台盼蓝染色判断细胞活力,活细胞比率大于95%；Ⅷ因子免疫组化染色,镜下可见98%以上细胞染色呈阳性。

2.2 MTT细胞活力检测 刺激1 h后采用MTT法检测细胞活力。A组细胞OD 值为（0.152±0.011）。与A组相比，B组（0.121±0.010）细胞活力降低（P<0.05），C组（0.143±0.012）其OD值较B组明显升高（P<0.05）, 心肌细胞活力提高。

2.3 流式细胞仪凋亡检测A组细胞凋亡率为（13.7±2.2）%。与A组相比，B组（34.5±2.3）%细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。与B组相比，C组（21.9±2.5）% 细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。

2.4细胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平 A组细胞胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平较低。与A组相比，B组细胞胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平明显升高。与B组相比，C组细胞胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平明显减少。见图1。

3 讨论

核转录因子指一类能和某些特定基因启动子区固定核苷酸序列结合从而启动该基因转录的蛋白质。NF-κB 是其中一种具有多向性调节作用的核转录因子，也是多种信号传导途径的汇聚点，在调节机体免疫、炎症、细胞再生、凋亡等过程中发挥关键作用[3]。NF-κB由p50和p65亚基形成二聚体，在静息状态下，NF-κB与κB抑制蛋白IκB（以IκB-α最为重要）结合以无活性方式存在于胞质中。当细胞受到外界刺激时（如肿瘤坏死因子α、脂多糖、氧化剂、蛋白激酶激活剂等），IκB发生磷酸化而降解，使NF-κB与其解离并迅速发生核移位，发挥转录活性[4]。严重烧伤患者早期血清中多种炎症因子普遍升高，已有研究报道NF-κB信号通路是烧伤血清刺激下内皮细胞结构与功能紊乱的中心环节之一[2]。本实验结果显示，空白对照组内皮细胞胞核几乎无NF-κB阳性表达，烧伤血清刺激1h后细胞胞核NF-κB表达增强，与其变化趋势相一致的是内皮细胞损伤明显、细胞凋亡显著增加；而给予NF-κB特异性阻断剂预处理，伴随着烧伤血清刺激后细胞胞核NF-κB表达回落，内皮细胞损伤及细胞凋亡也显著减轻。说明内皮细胞NF-κB在烧伤血清诱导下发生明显核移位并可能在内皮细胞损伤中扮演重要角色。

防治严重烧伤后内皮细胞损伤, 维护内环境稳定一直是烧伤防治的一个重点。本研究初步证实NF-κB参与严重烧伤后内皮细胞损伤, 因此，采取阻断NF-κB的策略对于防治严重烧伤后内皮损伤可能具有一定的潜在意义, 深入探索具有靶细胞特异性和对不同NF-κB成员具有选择性的细胞内NF-κB活化阻断剂，可能是防治严重烧伤后内皮细胞功能紊乱的一个重要方向。

[参考文献]

[1]杨宗城. 烧伤后血管内皮细胞损伤及其在早期脏器损害中的作用[J].中华烧伤杂志,2001,17(3): 133-135.

[2]Chen XL,Xia ZF,Wei D, et al. Expression and regulation of vascular cell adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells induced by sera from severely burned patients[J].Crit Care Med, 2004, 32 (1): 77-82.

[3]Mankan AK, Lawless MW, Gray SG, et al. NF-kappaB regulation: the nuclear response[J].J Cell Mol Med, 2009, 13 (4):631-643.

[4]Hayden MS, Ghosh S. Shared principles in NF-kappaB signaling[J].Cell, 2008, 132 (3):344-362.

[5]朱桂英,张捷,蔡景龙. NF-κB信号转导通路在瘢痕疙瘩中的异常表达[J].中国美容医学,2008,17 (11):1631-1634.

[收稿日期]2011-08-19[修回日期]2011-10-25

编辑/张惠娟