IETM对拟阿尔茨海默病大鼠认知功能及APP、PS1基因表达的影响

赵楠 韩柏 王锋 韩德五

[摘要] 目的 探讨肠源性内毒素血症（IETM）对拟阿尔茨海默病（AD）大鼠认知功能和β淀粉样前体蛋白（APP）、早老素1（PS1）基因表达的影响。 方法 选用Wistar大鼠，连续注射D-半乳糖和AlCl3 90 d制备拟AD动物模型。运用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，鲎试剂法检测脂多糖（LPS）含量，ELISA法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，RT-PCR法检测APP、PS1基因的表达。 结果 拟AD大鼠逃避潜伏期延长（P ＜ 0.05），LPS、TNF-α水平增加（P ＜ 0.05），且APP、PS1基因表达水平增加（P ＜ 0.05）。 结论 拟AD大鼠模型伴有IETM，其可能是AD发生的危险因素。

[关键词] 阿尔茨海默病；肠源性内毒素血症；肿瘤坏死因子-α；β淀粉样前体蛋白；早老素1

[中图分类号] R749.16[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）16-0004-02

Effect of IETM on neurocognitive function and hippocampal APP, PS1 gene expression in Alzheimers disease rats

ZHAO Nan1 HAN Bai1 WANG Feng2 HAN Dewu2

1.Department of Psychiatry, First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Institute of Liver Diseases, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intestinal endotoxemia (IETM) on neurocognitive function and amyloid precursor protein (APP) and presenilin 1(PS1) gene expression in rats with Alzheimers disease (AD). Methods The AD experimental rats injected D-galactose and AlCl3 for 90 days. Subsequently, neurocognitive function of the rats were assessed by Morris water maze; the level of lipopolysaccharide (LPS) was determined by TAL, tumor necrosis factor-α (TNF-α) was determined by ELISA; Hippocampal gene expressions of APP, PS1 were tested by RT-PCR. Results Compared with the normal control group, the experimental group had increased the escape latency (P ＜ 0.05) in Morris water maze test; LPS, TNF-α in AD rats were increased (P ＜ 0.05); the expressions of APP and PS1 mRNA in hippocampus were increased (P ＜ 0.05). Conclusion The rat model of Alzheimers disease is accompanied IETM and that may be a risk factor in the development of AD.

[Key words] Alzheimers disease; Intestinal endotoxemia; Tumor necrosis factor-α; Amyloid beta-protein precursor; Presenilin 1

阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种神经退行性疾病，发病机制尚不明确。多数学者认为AD的发病与β淀粉样蛋白（Aβ）沉积所致的慢性炎症有关，Aβ沉积被认为是AD患者脑部的毒性来源。研究结果显示，AD是一种自身毒性的改变，炎性反应在其中起重要作用[1]，在AD患者脑内可观察到明显的炎性反应和自主免疫反应[2]。肠源性内毒素血症（IETM）假说[3，4]认为，内毒素激活枯否细胞所分泌的多种活性物质是导致多种病理过程发生凋亡和炎症反应的重要机制。本研究通过应用D-半乳糖和AlCl3建立拟AD动物模型[5]，观察大鼠学习记忆能力，并检测血浆LPS、TNF-α含量以及海马APP、PS1基因表达水平，从而探讨IETM在AD发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物

成年Wistar大鼠60只（雌雄各30只，体重230～300 g），山西医科大学动物实验中心提供。

1.2 仪器和试剂

DU640型核酸蛋白分析仪（Beckman公司），UNOII型PCR仪（Biometra公司），鲎试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司），TNF-α试剂盒（北京东亚免疫技术研究所）等。

1.3 制备拟AD动物模型

60只Wistar大鼠随机分为对照组和模型组，模型组连续注射D-半乳糖[60 mg/（kg·d），生理盐水配制]和AlCl3[5 mg/（kg·d），双蒸水配制]90 d；对照组注射等量生理盐水和双蒸水。

1.4 Morris水迷宫实验

采用Morris水迷宫法测试大鼠认知功能[6]，记录大鼠游到终点的时间（逃避潜伏期）。

1.5 LPS、TNF-α测定

腹主动脉取血，严格按试剂盒说明检测。

1.6 APP和PS1基因表达的检测

提取大鼠海马mRNA，应用RT-PCR技术检测APP和PS1基因的表达。

1.7 统计学处理

用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，数据以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验

两组大鼠潜伏期随着训练次数增加而缩短。经过重复测量方差分析可认为5个时间点间5个时间段的潜伏期存在二次曲线的变化趋势（F = 6.937，P ＜ 0.01）；两组间比较差异有统计学意义（F = 4.937，P ＜ 0.05）。见表1。

表1 两组大鼠逃避潜伏期的比较（x±s）

注：与对照组相比，*P ＜ 0.05

2.2 LPS、TNF-α的变化

模型组LPS、TNF-α及脑细胞凋亡水平较对照组均明显升高（t = 3.21、2.95、4.67，P ＜ 0.05），说明在模型组大鼠体内发生了内毒素血症。见表2。

表2 两组大鼠血浆LPS、TNF-α含量及凋亡率（x±s）

注：与对照组相比，*P ＜ 0.05

2.3 海马内APP和PS1基因表达的比较

表3和图1、2可看出模型组APP、PS1表达水平较对照组高（P ＜ 0.05）。

表3 两组大鼠APP、PS1基因的表达（x±s，%）

注：与对照组相比，*P ＜ 0.05

3 讨论

AD是由多种因素共同作用形成的。活化的小胶质细胞（MG）是AD的又一病理特征，MG的激活是神经元死亡的早期事件[7]。近年来研究表明，Aβ聚集能活化MG和星形胶质细胞，引起炎症反应和神经毒性作用，是AD发病的核心机制[8]。MG、肝脏枯否细胞和血液中单核细胞均属单核巨噬细胞系统，内毒素作为最敏感的激活剂[9]，可激活免疫细胞触发炎症因子级联反应。当内毒素激活大量MG，可释放多种细胞因子、补体及其激活物等[10]，从而诱发炎症反应、自由基聚集、钙离子平衡紊乱，导致细胞凋亡，可能是AD发生的重要机制。LPS作为IETM的核心成分，可直接损伤细胞，并激活枯否细胞和单核细胞，释放更多的促炎介质（TNF-α、IL-1等）介导组织损害。TNF-α可大量存在于老年斑周围，还可上调环加氧酶2，增加有害自由基的产生[11]，进一步加重炎症反应。

本研究揭示D-半乳糖和AlCl3建立的拟AD大鼠模型可在基因水平调控APP和PS1基因，使其表达增高。研究结果表明，模型组大鼠体内LPS水平高于对照组（t = 3.21，P ＜ 0.05），说明在模型组大鼠体内发生了IETM；我们还观察到模型组认知功能明显下降（F = 6.937，P ＜ 0.01），且APP和PS1基因表达水平增加，提示IETM可使AD大鼠认知功能下降，可能与APP和PS1基因表达上调有关；模型组大鼠体内TNF-α水平高于对照组（t = 2.95，P ＜ 0.05），提示高水平TNF-α发挥了神经毒性作用，与AD的发病有关。

综上所述，在体内增高的LPS刺激下，TNF-α水平升高，与此同时，LPS可诱导模型大鼠脑内APP和PS1 mRNA的表达，从而促进脑组织Aβ沉积。本实验结果表明，拟AD大鼠模型有IETM的发生，可致大鼠认知功能下降以及血浆LPS、TNF-α含量和海马APP、PS1基因表达水平的增加。由此可见，IETM可能是AD发生过程中一个重要的危险因子，通过本研究能够为明确AD的发病机制提供新的思路和理论依据。

[参考文献]

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（收稿日期：2012-03-16）