骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究

张蓉　邓炜焯　郭增良　高瞻

[摘要] 目的：探索骨髓间充质干细胞膜片的体外构建简便方法，并评估其成骨分化潜能。方法：将兔骨髓间充质干细胞高密度接种，在成骨诱导条件下连续培养形成细胞膜片。通过组织学、碱性磷酸酶活性定量检测、透射电镜和扫描电镜等方法，检测细胞膜片的特性。结果：高密度连续培养及成骨诱导后形成骨髓间充质干细胞膜片。HE染色证实膜片是一种由多层细胞和细胞外基质组成的聚集体；茜素红染色呈阳性；碱性磷酸酶定量分析含量较高；扫描电镜及透射电镜检查均见基质中大量的矿化结节聚集。结论：通过体外简单的连续培养和成骨诱导后，可形成具有良好成骨能力的骨髓间充质干细胞膜片。

[关键词]间充质干细胞；细胞膜片；成骨分化

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）10-0-0

组织工程技术的出现和兴起标志着再造时代的来临，传统的基于细胞的骨组织工程，是利用大量的种子细胞种植在支架材料上，通过活性因子等诱导细胞分化成骨[1]。但研究发现该方法存在一些缺点，如细胞利用率低、附着效率差； 细胞在支架材料上分布不均；常用的蛋白酶消化收集细胞的方法，会改变细胞的表型和生化成分。并且，培养过程中细胞分泌的细胞外基质及形成的细胞间连接蛋白也常被破坏[2]。目前这些问题一直未能圆满解决，已成为限制骨组织工程技术应用于临床的瓶颈。

1993年日本学者Okano等[3]首先报道将聚N-异丙基丙烯酰胺应用到细胞培养上，创新性地发明了细胞膜片技术。应用特殊的外源性温敏聚合物材料提取完整的细胞聚集体，用于组织工程构建。该技术借助细胞间的连接以片状形式脱附，保留了基质中细胞与细胞间连接、细胞表面蛋白等，细胞生物学行为和功能得以维持[4]。在本实验中，笔者探讨体外构建骨髓间充质细胞膜片的培养方法并予以改进，试图进一步缩短膜片培养时间，同时增加膜片厚度，以利于构建组织工程骨。

1材料

1.1 实验动物：3月龄成年新西兰大白兔，体重2.5～3.0kg，由乌鲁木齐总医院实验动物中心提供。

1.2 实验仪器设备：倒置相差显微镜及照相系统（Olympas，日本）；酶联免疫检测仪（BIO-RAD680， 美国）；JEM-2000EX透射电镜 （JEOM Ltd，日本）；S-3400N 扫描电镜 （Hitachi，日本）；X-射线能谱分析仪（Oxford，Link ISIS，英国）。

2方法

2.1 兔骨髓间充质干细胞膜片体外构建：按以往所报道的实验方法分离培养MSCs[5]。将第2代MSCs，按密度1×106/cm2接种到直径10cm的培养皿，使用含成骨诱导剂的DMEM/F12培养液（含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸钠10mM、抗坏血酸 50mg/L）， 置于37℃，5%CO2培养箱孵育，隔日换培养液1次。连续培养直至皿底形成半透明乳白色薄膜样物。

2.2 组织学检查：4%多聚甲醛固定膜片，分别行HE和茜素红组织学染色。光镜下观察膜片显微结构。

2.3 超微结构观察：同时选取部分膜片，以3% 戊二醛固定，分别行透射电镜观察及扫描电镜观察标本表面的微细形貌。并选择矿化结节中心点检测，通过X-射线能谱分析仪了解矿化结节表面的元素组成。

2.4 碱性磷酸酶活性定量测定：细胞膜片加入裂解液（0.2% TritonX-100），充分裂解后离心，取上清与磷酸硝基苯基磷酸盐37℃反应30 min，酶联检测仪（405 nm波长）测光吸收值，行ALP活性定量检测。

3结果

3.1 膜片大体观察：MSCs高密度接种后体外培养5天左右，形成薄膜样物质，并逐渐增厚，12～14天，所获膜片具备一定的弹性和较好的机械性能，呈现半透明乳白色（如图1）。小心用细胞刮刀沿培养皿底刮擦，将膜状物与皿底分离，可用眼科镊将其完整夹持起来，进行卷曲或折叠等操作。

3.2显微结构观察：MSCs增殖旺盛，3天后呈复层生长，逐渐由梭形变为胞体较小的立方形，并出现多角形成骨样细胞，胞质颜色变深。继续诱导后，胞外基质分泌逐渐增多，钙盐不断沉积，14天左右形成不透光矿化结节，见图2。

3.3 组织学观察：HE染色显示，膜片是由12～15层细胞及细胞外基质组成的聚集体（图3A）。茜素红染色见细胞外基质中沉积有多个大小不等的钙化结节（图3B），表明膜片具有成骨能力。

3.4 超微结构观察：TEM观察膜片两面均有细胞，排列成多层结构。高倍镜下可见粗面内质网及胶原纤维丰富（图4），说明合成和分泌蛋白质功能旺盛。细胞外基质内大量针状钙盐结晶沉积，部分为局灶性的。SEM见成骨诱导分化的膜片中细胞被自己所分泌的细胞外基质包埋，基质中见大量矿化结节聚集（图5）。矿化结节X射线能谱分析结果显示有钙、磷、碳、氧、钠、镁六种元素构成，钙、磷两种元素的重量构成分别为（10.09 ± 0.01）% 和（4.53 ± 0.01）%，比值为2.23（图6A）。

3.5 碱性磷酸酶活性定量检测：结果表明，膜片成骨诱导分化后ALP活性随着时间延长而稳步增加，至第14天ALP值达到峰值， 见图6B。

4讨论

目前利用细胞膜片技术，已成功构建出角膜、皮肤、肝脏、心肌、血管等多种软组织[6]。细胞膜片技术的优点在于：①种子细胞利用效率高，体外扩增的细胞几乎可全部被用于组织构建；②细胞与细胞外基质复合体可直接用于组织构建，通过叠层实现三维构建，可避免使用外源性支架材料伴随的一些反应，更具有良好的生物相容性；③保留了细胞-细胞间、细胞-基质间连接和细胞表面蛋白等。

近期国内也有将骨髓间充质干细胞细胞膜片应用于骨组织工程的研究报道[7-8]，但该技术需要特殊的温度敏感性培养皿和提取设备，通过温度变化，20min左右细胞与细胞外基质一起脱落形成完整的细胞片层。马东洋[9]等实验所构建的骨髓间充质干细胞膜片，采用DMEM培养基，膜片厚度仅100 μm 左右。Sonja[10]研究发现，选择恰当的培养基对于细胞生长和增殖非常重要，并证实了选用DMEM/F12培养基，MSCs增殖率最高。本实验，改进了以往细胞膜片的体外构建方法，选择DMEM/F12培养基促进MSCs增殖，同时利用抗坏血酸促进MSCs扩增和分泌大量胞外基质，缩短了以往的培养时间， 4～5天即可形成薄层膜片，经过12～14天左右的连续诱导培养，HE染色显示膜片的多层结构厚度增加到200μm以上，膜片相应的弹性和机械性能也随之增加，更便于操作。用两把镊子就可将细胞膜片完整提起来，仅仅需要几秒钟，不必借助特殊的材料或设备，简捷的可操作性，更利于膜片的进一步塑形和三维构建。

实验证实，经上述条件培养液孵育的细胞膜片具有成骨分化的潜能。经定量分析膜片中的细胞具有较高的ALP活性。此外，茜素红染色表明膜片基质中有大量大小不等的钙化结节形成，证实了MSCs向成骨细胞分化后期的表型特征。同时扫描电镜、透射电镜下都观察到矿化的细胞外基质。尤其是，对膜片中的矿化结节进行X射线能谱分析结果显示有钙、磷、碳、氧、钠、镁六种元素构成，钙、磷两种元素的重量构成分别为（10.09±0.01）% 和（4.53±0.01）%，比值为2.23，接近于天然骨。细胞膜片工程研究将为骨组织再生重建开辟广阔的前景。

[参考文献]

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[3]Okano T， Yamada N， Sakai H， et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly （N-isopropylacrylamide）[J].J Biomed Mater Res，1993，27（10）：1243-1251.

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[9]马东洋，马敬，姜东红，等.骨髓间充质干细胞膜片复合磷酸三钙陶瓷构建工程化骨组织的体内成骨研究[J]. 中国美容医学， 2011，20（3）：408-410.

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[收稿日期]2012-06-11 [修回日期]2012-08-17

编辑/张惠娟