Zn2+和Cd2+单独及联合作用对青蛤消化酶活性的影响

张雨洁 倪小英 应雪萍

摘 要 以酶学分析的方法研究了两种金属离子单独及联合作用对青蛤蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力的影响，两种金属离子单独及联合作用时的浓度分别设置为10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L，染毒时间为4天。实验结果表明，青蛤3种消化酶活力大小为淀粉酶＞蛋白酶＞纤维素酶；在实验设置的染毒浓度范围内，Zn2+、Cd2+单独及联合作用对青蛤的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力均产生显著影响。其中，40mg/L的Zn2+对蛋白酶有显著的激活作用，3种较高浓度的Zn2+及2种中间浓度的Zn2++Cd2+对纤维素酶表现出显著的激活作用，其余的均对青蛤的这3种消化酶表现为抑制作用，且不同浓度的金属离子对这3种消化酶的抑制作用表现出不同的变化趋势。

关键词 金属离子 青蛤 蛋白酶 淀粉酶 纤维素酶

中图分类号：Q5文献标识码：A

The Individual and Combined Effects of Zn2+and

Cd2+to the Activity of Clam Digestive Enzyme

ZHANG Yujie, NI Xiaoying, YING Xueping

(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325027)

Abstract Enzymatic method for the analysis of two metal ions separate and combined effects of clam protease, amylase and cellulase activity of the two separate and combined effects of metal ion concentrations were set at 10mg / L, 20mg / L, 40mg / L and 80mg / L, exposure for 4 days. The results show that clam three kinds of digestive enzymes amylase size> protease> cellulase; set exposure concentrations in the experimental range, Zn2+, Cd2+ separate and combined effects of clam protease, amylase and cellulose enzyme activity were a significant impact. Which, 40mg / L of Zn2+ significant protease activation, three kinds of high concentrations of Zn2+ and two kinds of intermediate concentrations of Zn2+ +Cd2+ cellulase showed significant activation, and the rest are for the three clam showed inhibition of digestive enzymes, and different concentrations of metal ions in these three kinds of inhibition of digestive enzymes showed a different trend.

Key words metal ions; clam; protease; amylase; cellulase

青蛤，是一种常见的底栖贝类，具有很高的营养价值和经济价值，是我国南北沿海滩涂传统养殖的主要贝类之一。自1990年室内人工育苗获得成功，有关青蛤人工育苗和养殖技术方面的研究比较活跃，而其生理生化方面的报道相对较少。本文以青蛤为研究对象，探讨两种重金属离子单独及联合作用对青蛤消化酶活力的影响，并分析了金属离子对其消化酶的影响机制，以期为深入研究金属离子消化生理和洁净养殖生产提供科学依据，也为重金属对青蛤毒理学的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用的青蛤成体取自温州灵昆养殖场，选择健康、大小较一致的个体作为实验对象，平均壳长3.41?.22cm，壳宽3.56?.25cm，壳高1.98?.18cm。实验前青蛤成体先在海水中暂养两天。

1.2 染毒处理

实验用的药品ZnCl2和CdCl2·2.5H2O均为分析纯，实验浓度均以金属离子浓度计算。根据预备实验结果（Zn2+对青蛤的96hLC50为160mg/L）以及变量一致原则，Zn2+和Cd2+单独及联合作用中浓度梯度的设置为0、10、20、40、80mg/L。每个浓度35只青蛤，设三组平行组并设对照组（实验室配制养殖水，盐度约30‰）。每隔24h更换相应浓度的溶液，移除代谢产生的粪便。实验期间不投饵、不充气。

1.3 酶活性测定

取染毒4天后的青蛤活体，将其置冰盘内解剖，取出肝胰腺，剔除多余的组织块，作为酶液制备的样品。取大约1g湿重的上述样品，加入10倍体积（w/v）预冷重蒸水，在冰浴中充分研磨匀浆10~15min，所得匀浆液再置于冷冻离心机（转速10000r/min，温度4℃）中离心30min，最后取上清液测定酶活，24h内完成测定，酶活力的测定参照蒋传葵等的测定方法，略有修改。

1.4 数据分析

所有数据用平均值北曜嘉蟊硎荆采用单因素方差（ANOVE，SPSS for Windows，版本11.5）分析对照组和实验各组间的差别。P＜0.05，认为差异显著。

2 结果

2.1 不同浓度的Zn2+、Cd2+单独及联合作用对淀粉酶活力的影响

在实验设置的浓度范围内，金属离子Zn2+、Cd2+单独及联合作用均显著影响着淀粉酶的活力，且各处理组酶活力与对照组间均达到显著性差异。在各处理组中，随着试验设置浓度的增加，Zn2+对淀粉酶活力影响的变化趋势表现为先升后降再升，在浓度为20mg/L时酶活达到最大。Cd2+对青蛤淀粉酶活力的影响规律与Zn2+类似，只是在20mg/L达到较大值后一直保持下降趋势，在80mg/L时达到最小值，且各处理组酶活力之间达到显著性差异。两种金属离子联合作用时的变化趋势与Cd2+一致，且80mg/L作用时酶活性与Cd2+40mg/L、80mg/L处理组的酶活性之间无明显差异，但在10、20mg/L这两个浓度之间Zn2++Cd2+作用的酶活力差异不如Cd2+显著。

2.2 不同浓度的Zn2+、Cd2+单独及联合作用对蛋白酶活力的影响

青蛤蛋白酶对不同浓度不同金属离子的敏感性不同，其总体变化趋势也存在着一定的差异。在各处理组中，随着试验设置浓度的增加，Zn2+作用时蛋白酶活力的变化趋势表现为先降后升再降，在40mg/L时达到最大值，且显著高于对照组，表现为促进作用。Cd2+作用时则呈现“先升后降”的变化趋势，也在40mg/L时达到最大值，但与Zn2+40mg/L的酶活力存在着显著差异，而与对照组相比，差异不显著，抑制作用不明显。两种金属离子联合作用时对蛋白酶活力的影响一直保持下降的趋势，10、20mg/L作用时酶活力之间差异不明显，20、40mg/L作用下蛋白酶活力急剧下降，差异非常显著，40、80mg/L作用时酶活性继续显著性下降。

2.3 不同浓度的Zn2+、Cd2+单独及联合作用对纤维素酶活力的影响

不同浓度的金属离子对青蛤纤维素酶活力有着不同程度的不同影响。在试验设置的浓度范围内， 10mg/L的Zn2+抑制纤维素酶的活性，但高浓度则能激活酶的活力，且随着浓度的升高对酶的激活作用显著性下降。与对照组相比较，Cd2+显著性抑制青蛤纤维素酶活性，但各处理组间均无显著性差异，在数值上有先升后降再升的变化趋势。两种金属离子联合作用时对纤维素酶活力的影响规律与Zn2+一致，皆表现先升后降的变化趋势，在20mg/L时达到最大值，且各处理组间及其与对照组间均达到到显著性差异。只是两种金属离子联合作用时在试验浓度设置的两端对纤维素酶表现为明显抑制作用，在其中间则表现为显著的激活。

3 讨论

3.1 金属离子对消化酶活力的影响

金属离子能以不同的方式与底物、酶的活性产物和酶本身产生极强的亲和力，从而导致酶活性的改变，有些能对酶活性产生抑制作用，有些则激发酶的催化功能。本文研究发现，同种金属离子，对同种生物的不同消化酶（如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶）的作用存在较大的差异；不同种金属离子对不同生物种类消化酶的影响不同，两种金属离子联合作用时表现效果与两者单独作用并不一致，有时高于两者的单独作用，有时则低于两者单独作用，其联合作用对消化酶活力的影响受到多方面因素的制约；不同浓度的金属离子对同种生物的消化酶活性的影响亦不相同。

3.2 金属离子对青蛤消化酶影响机制的探讨

金属离子以被动转运的方式进入生物体内后，首先会引起机体内酶和一些生物大分子的改变，进而逐步在细胞、器官、个体、种群和生态系统各个水平上反映出来。然而，许多海洋生物会以解毒贮藏或积累金属的方式来保证生命活动代谢。本实验研究表明，两种金属离子单独及联合作用时对青蛤3种消化酶活力的影响表现出不同的变化趋势，这可能是由于金属离子对不同消化酶的作用机制不同。

金属离子在分子水平上的致毒机理主要有3种作用类型：（1）摄入的有害金属阻碍生物大分子的重要功能；（2）有害金属取代生物大分子中的必需金属，使其丧失生物活性；（3）有害金属改变生物大分子活性部位的构象，从而改变其生物活性。Zn2+对青蛤的致毒效应一般认为是第3种。锌作为一种重要的必需微量元素，当其浓度超过生物的生态幅度时，多余的Zn2+就会与其它生物大分子（如酶、核酸等）相互作用，引发中毒。不同消化酶对不同浓度的Zn2+的应答变化不同，则认为与金属硫蛋白（MT）的合成有关，金属硫蛋白可以螯合和贮存多余的锌，或与锌形成Zn-MT结合物，来维持细胞内Zn2+的浓度，以减轻其毒性。当青蛤体内累积的Zn2+浓度过高时，Zn2+与MT将达到饱和，而溢出到其他生物大分子如酶上，引起酶活性降低。Zn2+在一定浓度时分别对青蛤蛋白酶、纤维素酶表现出一定的促进作用。由此可说明某些金属离子的高积累并不会对生物造成危害，而且这些金属离子在一定浓度下甚至能够通过酶的作用来提高贝类的摄食和消化吸收功能。

镉作为生物体非必需元素，是一种有毒的重金属，它不仅可以取代其它金属离子（锌、钙、铜等）在蛋白中的位置，还可以与含—SH的大分子基团（如酶、核酸等）紧密结合以产生致毒效应。研究发现，Cd2+显著抑制了青蛤3种消化酶的活性。关于其对酶活性的抑制机制，作者推测与Zn2+相似。

各种水生生物生长受到多种重金属联合作用的综合影响，重金属间的相互作用大致有拮抗、协同、相加等类型。实验结果表明，Zn2+和Cd2+联合作用在低浓度时对青蛤的3种消化酶表现为拮抗，而在高浓度时对淀粉酶和蛋白酶具有协同抑制作用，对纤维素酶依旧表现为拮抗作用。锌与镉联合作用对软体动物消化酶的影响是相互制约、相互联系的，至于其进一步的机制还有待于深入探讨。