血管抑素对血管内皮细胞中的VEGF表达的影响

刘子彬 刘海俊 许丹丹 封亮旗

[摘要]目的：探讨不同浓度的血管抑素对血管内皮细胞中VEGF表达的影响。方法：将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为三组：对照组(空白组)、A组(16mg／L血管抑素组)、B组(32mg／L血管抑素组)，通过MTT、RT-PCR、Western-Bolt等方法检测细胞内VEGF的表达情况。结果：随着血管抑素作用时间的延长和浓度的递增对人脐静脉内皮细胞的抑制作用也逐渐增强，且与对照组相比差异均有显著性意义(P<0.05)。结论：血管抑素通过抑制VEGF的表达以抑制人脐静脉内皮细胞增殖，从而抑制血管新生。[关键词]血管抑素；血管内皮细胞；血管内皮生长因子；角膜新生血管；免疫蛋白印迹技术；时间浓度依赖

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2012)07-1165-03

血管新生是导致角膜透明度下降、免疫豁免功能丧失等重要因素之一，因此，抑制角膜血管新生对于眼科尤为重要；血管新生是通过血管内皮细胞的迁移、增殖等方式实现血管生长：血管抑素是目前发现作用最强、实验效果最好的血管生成抑制剂。本实验观察血管抑素对体外培养的人脐静脉内皮细胞的抑制作用。

1材料和方法

1.1材料：Lysine-Sepharose 4B(Pharmacia公司)；弹性蛋白酶、胶原酶、十二烷基磺酸钠、氯仿、胎牛血清、二甲基亚砜、MTT(sigma公司)；Tris碱(Promega公司)：健康新生儿脐带由解放军第421医院提供；蛋白分子质量标准、胰蛋白酶(华美生物工程公司)；盐酸赖氨酸、6-氨基己酸；小鼠抗人VEGF多克隆抗体和小鼠抗人β-actin多克隆抗体(美国BD公司)；超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)；全蛋白提取试剂盒及BCA法蛋白浓度测定试剂盒(南京凯基公司)；辣根酶标记抗小鼠IgG(北京中杉金桥)：血管抑素K1-4(环球碧澳公司)。

细胞总RNA提取试剂盒RNAiso Plus、逆转录试剂盒及PCR试剂盒均购自TaKaRa公司。PCR引物设计利用Primier5.0设计，由上海英骏生物技术有限公司合成引物序列VEGF引物序列(127bp)：5-TGGACCCTGGCTTTACTGCTG-3，5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA-3。GAPDH引物序列(133bp)：5_GAEAACTTTGGCATCGTGGA-3，5-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3。

1.2方法

1.2.1人脐静脉细胞培养：无菌条件下切取血管，长lOcm，直径约大于5mm；用装有PBSA的注射器冲洗血管标本，去除血液和凝块：结扎一端，灌满胶原酶溶液，结扎另一端室温放置10min；从上端结扎处剪掉上端，收集血管内胶原酶，移入10cm培养血：用10ml PBSA冲洗内脏并收集到培养皿内的胶原酶液中；将收集到的消化液用离心法在培养液中洗2次；收集细胞，重新悬浮于培养液中，接种于铺有明胶的培养皿或瓶中；细胞长满后可常规胰蛋白酶消化法传代培养。

1.2.2 MTT法测定血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响：取3～5代人脐静脉内皮细胞稀释成单细胞后，接种于96孔板，每孔加入100μl，置于37℃、体积分数为0.05的CO²及饱和湿度培养箱中培养24h。当细胞形成单层细胞后弃上清，加入质量浓度为16mg／L、32mg／L血管抑素，每个质量浓度设3个复孔，对照组加入等量的含2g几二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液代替(即分为三组A组：空白对照组；B组：16mg／L血管抑素组：C组：32mg／L血管抑素组)，三组均作用72h后每孔加入5mg/LMTT溶液201M继续培养4h，弃上清，每孔加二甲基亚砜150μ1，振荡10min后酶标仪490nm读取吸光度值(A)(参考波长为570nm)，计算不同时间、不同质量浓度的血管抑素对人脐静脉内皮细胞的抑制率。抑制率=(对照组A490-实验组A490／对照组A490)×100％。

1.2.3荧光定量PCR反应：分别采用VEGF和GAPDH引物，以cDNA为模板试剂盒说明进行PCR特异性扩增，所有实验均重复3次，取3次结果的平均值为实验结果。

VEGF蛋白的western blot检测收集A组、B组、C组三组细胞。根据试剂盒说明操作，行ECL化学发光法检测，β-actin为内对照。

1.3观察指标：血管内皮细胞在血管抑素不同浓度下的生长情况；各组血管内皮细胞中VEGF蛋白的表达含量。

1.4统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包分析，所得数据以x±s表示，MTT实验数据采用析因设计资料方差分析，QRT-PCR结果数据进行方差齐性检验和One way ANOVA分析；方差齐的多重比较采用LSD法，方差不齐采用DennettsT3法；双侧检验P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响：MTT法测定血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响不同质量浓度的血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24h后，可见空白组细胞排列紧密，增生明显，有连成片的趋势；A组(16mg／L组)细胞呈点片状增生，排列疏密有致；B组(32mg/L组)细胞呈稀疏状排列。A490吸光度值均低于对照组，对内皮细胞增殖的抑制作用随着血管抑素浓度的增加而增加。血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24，48，72h后细胞明显受抑制，吸光度值均低于对照组。测定结果显示：当在血管抑素浓度不变的情况下，抑制作用随时间的延长而增强(F=493.245 P=0.000)：当血管抑素质量浓度从0，16，32mg／L逐渐加大剂量时，人脐静脉内皮细胞的抑制作用也逐渐增强(F=1964.224 P=0.000)，72h时最大抑制率达到80.00％，且与对照组相比差异均有显著性意义(P

2.2实时荧光定量PCR结果显示，以2作为统计量，经方差齐性检验得(F=168.425 P=-0.000)，各组间比均为P=O.000，各组之间均有统计学差异。与空白对照组比较；A、B组VEGF mRNA的表达分别下降了约4096、73％。(如表1、2和图1)

2.3血管抑素对VEGF蛋白表达的影响：Western blot结果显示血管抑素作用人脐静脉细胞后，三组中VEGF蛋白表达含量不同，且随着血管抑素浓度的增加和时间延长而减少(图2)。

3讨论

血管生成是指毛细血管从血管周围生成的过程“]，其在正常和病理情况下均能发生；血管抑素K1-4是纤溶酶原的降解片段并具有强大的抑制新生血管形成作用，可特异地抑制处于增殖状态的血管内皮细胞并诱导内皮细胞的凋亡，来发挥强大的抑制新生血管的作用，并且不影响静止的内皮细胞。

多项肿瘤研究报告证明，肿瘤的转移和生长依赖于血管的形成，因此抗血管新生成为抗肿瘤的一种最为重要的治疗手段。血管抑素于1994年被0Reilly等发现血以来，它以高效的抗新生血管生成作用且无耐药性等特点而倍受关注，是当前已知最为有效的血管生成抑制剂。本实验通过证明血管抑素是以抑制血管内皮细胞增生达到抑制血管形成，从而阻断角膜新生血管的形成，且能有效的促进已形成的新生血管萎缩。同时也证明了新生血管的内皮细胞是血管抑素作用的直接靶点之一，对其他细胞及正常状态下的血管内皮细胞未见明显抑制作用。

MTT实验结果显示血管抑素能显著抑制内皮细胞的生长，随着血管抑素浓度的增加其抑制作用亦显著增加：当血管抑素质量浓度逐渐加大时，随着作用时间的延长对其抑制作用也逐渐增强，具有剂量一时间的双重依赖性。国内外研究均证明了VEGF在血管新生过程起重要作用，抑制了VEGF的表达即可抑制新生血管的形成；实时荧光定量PeR结果显示，对照组与A组中的VEGF-mRNA的表达存在显著差异；对照组与B组比较存在显著差异，A组与B组比较存在显著差异。同时也显示、与空白对照组比较A、B组VEGF mRNA的表达分别下降了约40％、73％。证明了血管抑素抑制新生血管是通过抑制VEGF的表达。Western blot结果再次证明血管抑素作用人脐静脉内皮细胞后，VEGF蛋白表达的改变，随着血管抑素浓度的增加和时间延长而减少。

角膜新生血管的生长亦是通过血管内皮细胞的增殖、迁移等方式实现血管新生。血管抑素通过作用VEGF靶点在体外细胞培养过程中显示了强大的抗血管内皮细胞增殖、迁移等作用，从而抑制了新生血管的延长、甚至引起已形成的新生血管萎缩、退化。上述实验为血管抑素在治疗眼科角膜新生血管提供有力的支持。为下一步的动物实验及临床实验打下基础。