脑缺血大鼠脑组织中强啡肽A（1－8）含量及含水量的变化＊

西安交通大学医学院第二附属医院（西安710004）

展淑琴△ An Zhou△ Tao Yang△ 郭新奎 黄 芳

强啡肽（DYN）是中枢神经系统广泛分布于脑与脊髓中的一类重要的神经递质，DYN对κ受体的选择性较强，它是一种与应激有关的神经肽，有研究证实急性脑缺血不同时期脑、脑脊液和血液中内源性阿片肽浓度均发生明显变化，表明内源性阿片肽在缺血性脑损伤的病理生理过程中发挥着重要作用。强啡肽A（1－8）［DYN－A（1－8）］是一种含8个氨基酸的短链多肽，我们既往的研究发现给脑缺血小鼠脑室内注射合成的 DYN－A （1－8）可明显缩小脑梗死面积［1］，为观察局灶性脑缺血大鼠脑皮层及纹状体中DYN－A（1－8）含量的变化及局灶性脑缺血大鼠脑皮层及纹状体含水量的变化，我们进行了此项研究，现报道如下。

材料和方法

1 动物及组织准备 用大脑中动脉阻塞（MCAO）的方法建立短暂性局灶性脑缺血模型［2］。雄性Sprague－Dawley大鼠（体重250～300g）48只，购自Charles River Laboratories，大鼠在含700ml/L 一氧化二氮、300ml/L氧的气体中被40ml/L异氟烷麻醉，并以20ml/L异氟烷维持。MCAO组24只，通过引导一根3－0的丝线进入一侧颈内动脉腔，同时结扎颈外动脉及颈内动脉颅外段制造大脑中动脉阻塞模型，丝线在100min后被撤出并使再灌注达24h，在再灌注结束时间点（8h及24h），每组各12只大鼠在麻醉状态下被断头取脑，其中6只全脑立即在干冰上冷冻－80℃保存备用，另6只分离皮层及纹状体后进行皮层及纹状体含水量的测定。假手术对照组24只（8h及24h时间点各12只），麻醉、血管分离同上，但不行线拴及动脉结扎，余同MCAO组，其中6只全脑立即在干冰上冷冻，－80℃保存备用，另6只分离皮层及纹状体后进行皮层及纹状体含水量的测定。

2 脑组织处理 分离缺血侧脑皮层及纹状体组织，样品称重后匀浆处理，脑组织匀浆用含1mM EDTA及蛋白酶抑制剂的0.1MHCl缓冲液处理，100℃煮沸15min并立即在冰上冷却后于4℃13000rpm离心20min，吸上清液入一套新管，用Bradford法（Sigma－Aldrich）测定所有样本的蛋白浓度。

3 DYN－A（1－8）的放免测定 取含55μg蛋白的上清液行真空离心140min，真空抽干后的样本用放免法测定DYN－A （1－8）含量（pmol/g brain tissue；mean±s）。放免试剂盒购自Peninsula Laboratories inc。

4 脑含水量的测定 将大鼠断头取脑，剔除低位脑干及小脑，分离左右半脑，用滤纸吸去脑表面的水分，分离缺血侧皮层及纹状体后取各缺血侧皮层及纹状体组织装入称量瓶，电子分析天平称取各组各约120mg湿重的缺血侧皮层或纹状体组织 （精确到0.1mg），然后置于干燥箱内100℃烘24h至恒重后再称干重，按下列公式计算脑含水量：脑含水量（%）＝（湿重－干重）/湿重×100%。

结 果

1 DYN－A（1－8）含量的变化 见表1。随再灌注时间的延长，缺血脑皮层及纹状体内DYN－A（1－8）的含量逐渐下降。

表1 脑缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血侧脑皮层及纹状体内强啡肽A（1－8）含量的变化（pmol/g，±s）

表1 脑缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血侧脑皮层及纹状体内强啡肽A（1－8）含量的变化（pmol/g，±s）

注：与假手术对照组在同一部位及同一时间点相比aP＜0.05，与再灌注8h大鼠在同一部位相比bP＜0.05

8h（n＝6）24h（n＝6）组 别皮层 纹状体假手术对照组 5.58±0.61 7.72±0.92皮层 纹状体5.43±0.52 7.59±0.88脑缺血组 3.51±0.43a 5.62±0.71a 2.41±0.32ab 4.35±0.63ab

2 脑皮层及纹状体含水量的变化 见表2。缺血侧再灌注8h及24h的脑皮层及纹状体含水量均明显增加，与假手术对照组相比有显著性差异（P＜0.05），且再灌注24h的缺血侧脑皮层及纹状体含水量较再灌注8h增加，差异有显著性（P＜0.05）。

表2 脑缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血侧脑皮层及纹状体含水量的变化 （%）

讨 论

内源性阿片肽包括内啡肽、DYN、脑啡肽、内吗啡肽以及孤啡肽，它们存在于脑组织、脑脊液及血液中，是体内具有阿片样活性的一组物质，在体内发挥神经递质和激素的功能，对机体的心血管功能、内分泌免疫网络的调节以及消化系统、镇痛、呼吸系统等都有重要的调节作用。DYN包括DYN－A、DYN－B及α－新内啡肽。DYN－A是Goldstein等1979年从猪垂体中提取的一种阿片样活性极强的17肽DYN，DYN－B是1982年Goldstein和Udenfriend分别发现的另一种13肽DYN，其N末端还经一对碱性氨基酸与上述17肽DYN的C末端相接，它们在脑和脊髓内有广泛分布，其功能复杂多样。它是一种与应激有关的神经肽，DYN对κ受体选择性强，被认为是κ受体的内源性配体。近20多年来，对阿片肽的研究一直是神经科学领域研究的热点问题之一，内源性阿片肽在中枢神经系统中的作用也取得了很大进展。其中作为内源性阿片肽的β－内啡肽、DYN和脑啡肽与中枢神经系统损伤有着密切的关系。近年来，多数学者认为β－内啡肽、DYN－A、亮氨酸脑啡肽参与了中枢神经系统的继发性损伤［3］。脑啡肽参与了脑血管疾病的病理生理过程，引起一系列神经系统的症状。有研究证实急性脑缺血不同时期脑、脑脊液和血液中内源性阿片肽浓度均发生明显变化，表明内源性阿片肽在缺血性脑损伤的病理生理过程中发挥着重要作用。DYN参与中枢神经系统损伤后的继发延迟性病理损害过程，是阿片肽中作用最强的一种［4］。

本研究在假手术对照组大鼠及100min MCAO后再灌注8h缺血侧脑皮层及纹状体强啡肽A（1－8）的含量分别是5.58±0.61及3.51±0.43pmol/g，7.72±0.92及5.62±0.71pmol/g，假手术对照组大鼠及再灌注24h大鼠缺血侧脑皮层及纹状体强啡肽A（1－8）的含量分别是5.43±0.52及2.41±0.32pmol/g，7.59±0.88及4.35±0.63pmol/g，随再灌注时间的延长，缺血侧脑皮层及纹状体中强啡肽A（1－8）的含量逐渐下降（P＜0.05）。

从本实验结果看出短暂脑缺血后再灌注8h即出现缺血侧脑皮层及纹状体中DYN－A（1－8）含量的减少，且随着再灌注时间的延长，DYN－A（1－8）的含量进一步减少。我们的研究还发现在100min MCAO后，随再灌注时间的延长，缺血侧脑皮层及纹状体含水量增加，即随再灌注时间的延长DYN－A（1－8）含量减少的同时伴有脑皮层及纹状体水肿的加重。

DYN－A（1－8）由前蛋白转化酶PC2发挥蛋白水解作用而来，既往我们的研究中发现小鼠脑室内注射合成的 DYN－A（1－8）可明显缩小脑梗死面积［1］，提示DYN－A（1－8）在脑缺血时具有保护作用，具有治疗脑梗死的潜力。Silvia等［5］也证明DYN－A能够明显改善猫脑缺血后的神经机能缺损程度，延长生存时间，减轻脑组织损伤。另有些研究也发现沙土鼠侧脑室注射DYN－A后缺血大脑皮层Ca2＋含量大量降低，脑水肿明显减轻［6］；超低浓度的 DYN－A（1－8）显著阻止脂多糖引起的LDH释放、神经元的缺失及细胞形态学的改变［7］；在单侧脑缺血沙土鼠模型，DYN治疗可明显改善运动功能障碍［8］。

DYN－A （1－8）除与缺血性脑损伤关系密切外，还与痴呆、衰老、高血压等有关。Sunderland等［9］发现阿尔茨海默病患者脑脊液DYN－A（1－8）水平较对照降低了40%，DYN－A（1－8）有延缓细胞衰老的作用。Berman等［10］发现限制食物可增加伏核、终纹床核、外侧下丘脑的DYN－A（1－8）水平。海马的DYN系统与孤立引起的高血压的维持有关［11］，海马内的 DYN－A（1－8）通过中枢机制降低动脉血压。因此DYN－A（1－8）作用广泛，与多种疾病密切相关。

Kao等［12］的研究认为DYN－A有对抗脑缺血时脑水肿的作用，能使缺血后脑重量减少到缺血前水平，多项研究表明DYN－A（1－8）在脑缺血时具有脑保护作用，因此我们认为DYN－A（1－8）含量的减少会加重脑水肿，影响脑缺血后脑神经细胞的存活，DYN－A（1－8）具有临床治疗脑梗死的潜力。

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