荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的实验研究

李静波， 徐尤学， 方家华， 张祖海 (长江大学附属荆州市第一人民医院眼科， 荆州 434000;湖北省京山县罗店医院眼科;通讯作者，E-mail:zhangzuhai787@sina.com)

视网膜神经节细胞位于视网膜的内层，是视网膜的第三级神经元，其轴突组成视神经，将视觉信号输入大脑，在视觉通路中起着重要的传导作用。视网膜神经节细胞是青光眼以及视神经炎等病变的靶细胞，最近发现，视网膜中少数神经节细胞能够合成感光蛋白，具备了自主感光的能力，被称为自主感光神经节细胞［1］，因此，研究视网膜神经节细胞的电生理特征具有重要的意义。初生的乳鼠视网膜神经节细胞具有较强的活性，适合做膜片钳等电生理实验，在开展电生理实验之前，需要分离并鉴定细胞。

荧光金是一种性质稳定的荧光示踪剂，可用于视神经、坐骨神经等的标记。视网膜神经节细胞轴突在大脑上丘和外侧膝状体交换神经元，其中大部分投射到上丘，荧光金注射到上丘后，通过轴浆逆行运输，大约24 h后到达视网膜，视网膜神经节细胞胞体被标记，在荧光显微镜下可进行观察。国内已有荧光金逆行标记成年大鼠视网膜神经节细胞的报道［2］，但没有标记并分离乳鼠视网膜神经节细胞进行体外培养的报道。本研究中，我们拟建立荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的方法。

图1 显微镜下视网膜神经节细胞形态Fig 1 The morphology of retinal ganglion cells under microscope

1 材料和方法

1.1 乳鼠视网膜神经节细胞逆行标记 SD大鼠购自长江大学医学院，4%荧光金注射液购自Biotium公司。取出生1 d的SD大鼠乳鼠10只，按照350 mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。麻醉成功后，用碘伏消毒头顶皮肤，沿大鼠头顶正中线，使用消毒器械从前向后剪开头皮，暴露前囟和后囟。以后囟为坐标，后移0.5 mm，旁开1 mm，对应双侧上丘核。用1 ml注射器针头刺穿颅骨，然后使用5 μl的平头微量注射器，向下刺入3 mm，注射荧光金注射液1 μl，停留3 min拔出，一侧注射完毕后再注射另一侧，双侧均注射完毕后用5－0丝线缝合皮肤，碘伏消毒。麻醉复苏后，继续母乳喂养。

1.2 提取视网膜进行体外培养 在视网膜神经节细胞逆行标记后第4天，即乳鼠出生后5 d，用75%酒精全身喷洒乳鼠消毒，脱臼处死。取出眼球，放入装有PBS溶液的培养皿中，培养皿置于冰块上。解剖显微镜下沿眼球赤道部环形剪开眼球，取出视网膜。所有眼球的视网膜都取出后，将视网膜转移到0.125%的胰酶中，放置到37℃培养箱中消化10 min，轻轻吹打，去除较大的组织块。加入含20%胎牛血清的F12培养基终止消化，800 r/min离心5 min，吸出离心管上面的液体，加入含20%胎牛血清的F12培养基，重悬细胞。调整细胞密度后种植到培养皿中，放入含5%浓度二氧化碳的培养箱中培养，每3 d换液一次。

1.3 显微镜下观察被标记的细胞 在分离后7 d，21 d，使用Olympus IX71显微镜拍照，分别拍摄普通光及荧光图片。荧光金的激发波长为350－395 nm，发射波长为530－600 nm。显微镜下见标记的视网膜神经节细胞发出荧光。用Image-Pro Plus 6.0软件对分离后立即拍照的图像进行细胞计数。选取5张图片，对细胞总数及被荧光金标记的细胞分别计数，取平均值，计算被荧光金标记的细胞占所有细胞的百分比。

2 结果

视网膜用胰酶消化后，立即在显微镜下观察，可见混合培养的视网膜细胞成球形，单细胞状。有少量细胞被荧光金标记，大约占细胞总数的0.34%(图1A，1B，见第638页)。细胞培养1周后，视网膜神经节细胞长出轴突，胞体及轴突均有荧光(图1C，1D，见第638页)。培养3周后，视网膜神经节细胞轴突变短，细胞膜光泽变暗，胞体有颗粒样改变，仍可见胞体荧光，但细胞活性很差，核固缩，处于濒死状态。

3 讨论

本研究显示，通过向乳鼠大脑双侧上丘注射荧光金，可成功标记视网膜神经节细胞。在注射荧光金后4 d，提取视网膜细胞进行体外混合培养，被标记的视网膜神经节细胞在激发光照射后可发出荧光，此方法可用于鉴定视网膜神经节细胞。

用荧光示踪剂标记视网膜神经节细胞，常用于视网膜神经节细胞的计数，观察视网膜受到损伤后细胞数目的变化，以及视神经保护药物的神经保护作用。实验研究中，常用的示踪剂有荧光金，粒蓝，Dil等;常用的模型包括高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤模型，以及眼内玻璃体腔注射兴奋性毒素如谷氨酸引起的兴奋性损伤模型。我们曾报道，双七他克林可以减少兴奋性毒素引起的视网膜神经节细胞数目减少［3］。在这个视网膜兴奋性模型中，我们使用成年的SD大鼠，依照大鼠脑立体定位图谱［4］，向大鼠双侧上丘及外侧膝状体注射荧光金。上丘以前囟为零点，后移(6.8±0.2)mm，旁开(1.6±0.2)mm;外侧膝状体以前囟为零点，后移(4.6 ±0.2)mm，旁开(4.0 ±0.2)mm。在脑立体定位仪上注射药物，注射深度上丘为(4.0±0.2)mm，外侧膝状体为(5.6 ±0.2)mm。

利用体外培养的视网膜神经节细胞做膜片钳实验，需要使用刚出生不久的乳鼠细胞，这些细胞的活力强于成年大鼠细胞，但是需要鉴定。成年大鼠的颅骨表面投射坐标适用于体重180 g以上的大鼠［4］，而乳鼠体重只有几克，头部很小，尚未发育成熟，成年大鼠的坐标显然不适合乳鼠，并且乳鼠也无法放置到脑立体定位仪上操作。我们依据多次在成年大鼠注射荧光金的经验，确定乳鼠上丘的位置，位于后囟后0.5 mm，旁开1 mm，深度3 mm。由于大部分视网膜神经节细胞的轴突在上丘交换神经元，因此我们只标记了上丘，没有标记外侧膝状体，实验结果显示我们的定位是可行的。国外有报道，使用粒蓝标记乳鼠视网膜神经节细胞，但是，并没有对标记点的坐标位置进行描述［5］。

另外，我们的结果显示被标记的视网膜神经节细胞占全部视网膜细胞的0.34%，这个结果与以前的报道基本一致［6，7］。其中一篇报道指出，视网膜神经节细胞占全部视网膜细胞的百分比低于1%［6］，而另一篇报道中，视网膜神经节细胞占比约0.5%［6］。我们的结果比0.5%还要低，可能有两方面的原因:一是我们只标记了上丘，没有标记外侧膝状体，一部分细胞漏掉了;二是我们无法使用脑立体定位仪，难以确保每次都注射到相同的位置，可能有的注射点有偏移。

总之，本研究建立了一种用荧光示踪剂逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的方法，可用于视网膜神经节细胞的鉴定，有助于膜片钳等实验的开展。

［1］ 曾强，何士刚.视网膜中的自主感光神经节细胞［J］.生物物理学报，2011，27(5):387 －394.

［2］ 尹小磊，叶剑，陈春林.荧光金逆行标记观察正常大鼠视网膜神经节细胞及轴突［J］.标记免疫分析与临床，2006，13(4):218－220.

［3］ Zhang ZH，Liu YW，Jiang FG，et al.Bis(7)-tacrine protects retinal ganglion cells against excitotoxicity via NMDA receptor inhibition［J］.Int J Ophthalmol，2011，4:125 －130.

［4］ Paxinos G，Watson C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates［M］.4th ed.New York:Academic Press，1998:47.

［5］ Chen HS，Lipton SA.Mechanism of memantine block of NMDA-activated channels in rat retinal ganglion cells:uncompetitive antagonism［J］.J Physiol，1997，499(Pt 1):27 －46.

［6］ Kikuchi M，Tenneti L，Lipton SA.Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells［J］.J Neurosci，2000，20:5037 － 5044.

［7］ Shen S，Wiemelt AP，McMorris FA，et al.Retinal ganglion cells lose trophic responsiveness after axotomy［J］.Neuron，1999，23:285－295.