NANOG基因在宫颈癌组织中的表达及意义

邹 琪， 万丽娟， 康馥莉， 尚丽新 (北京军区总医院妇产科， 北京 100700;通讯作者，E-mail:19932003@163.com)

宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤，是危害我国妇女健康的头号杀手。目前国内外报道NANOG基因与宫颈癌、宫颈上皮内瘤变Ⅲ(CINⅢ)的发生具有相关性，Chambers等［1］和 Mitsui等［2］于2003年几乎同时报道NANOG基因，其有助于胚胎干细胞的自我更新及维护其未分化状态，并且促进细胞增殖。同时，大量研究发现NANOG基因在睾丸原位癌、乳腺癌、生殖细胞肿瘤的细胞中有表达［3－6］，由此推测NANOG可能是某些肿瘤的标志之一。但目前有关NANOG基因在宫颈癌、CINⅢ及正常宫颈组织中表达情况的研究还为数不多，本实验采用免疫组化方法检测其在宫颈癌组织中的表达，探讨NANOG与宫颈癌的发生、发展的关系，为宫颈癌的临床治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 随机抽取2008－01～2011－06在北京军区总院妇产科手术切除及活检存档的石蜡标本50例，其中行宫颈锥切的CINⅢ10例，行广泛全子宫切除+盆腔淋巴结清扫术的Ⅰ－ⅡA30例，同期因子宫肌瘤行全子宫切除的正常宫颈标本10例作对照。患者年龄38－66岁，中位年龄43岁。其中30例宫颈鳞状细胞癌根据国际妇产科联盟(FIGO，2009年)的临床分期:ⅠA2 11例，ⅡA2 19例。按肿瘤分化程度进行分级:高分化5例，中分化13例，低分化12例。盆腔淋巴结有转移者9例，无转移者21例。全部病例在术前均未接受任何治疗，临床及病理资料完整。病理诊断均由有经验的病理科医生诊断。

1.2 主要试剂 羊抗人NANOG多克隆抗体(Santa Cruz，sc-30331)、SP试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒均购自北京博奥森公司。

1.3 方法与结果判断 应用免疫组织化学SP法对组织切片进行染色。主要步骤按试剂盒说明书操作。二抗为Envision套盒，用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂显色，苏木精复染，常规脱水、透明、干燥、封片，显微镜下观察分析结果。阴性对照用正常羊血清代替一抗，其余步骤相同。所有切片的观察均由2－3名病理科医生独立在光镜下完成。以细胞质和/或细胞核上出现棕黄色颗粒为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件系统进行分析，两组间均数比较采用t检验，多组间样本率的多重比较采用卡方检验，各亚型之间的比较采用相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NANOG蛋白在正常宫颈、CINⅢ、宫颈癌组织中的表达 免疫组织化学染色结果显示，NANOG蛋白在宫颈癌组织中表达的阳性细胞多呈点状，偶有灶状聚集，主要位于细胞核，并且多表达于间质和癌巢交界的边缘(图1，见第637页)，其阳性表达率为90%(27/30)。在CINⅢ中，NANOG蛋白呈点状核表达，主要位于基底膜上皮细胞(图2)，其阳性表达率为70%(7/10);而在10例正常宫颈组织中则无NANOG蛋白的表达(图3)，表达率为0(0/10)。NANOG蛋白在宫颈癌和CINⅢ中的表达率显著高于正常宫颈组织(P＜0.05)，而在宫颈癌和宫颈原位癌中的表达无统计学差异(见表1)。

2.2 相关性分析 NANOG蛋白在宫颈癌组织中的表达与临床分期、淋巴结转移无相关性(P＞0.05)，但与组织分化程度有关(P＜0.05，见表2)。

表1 NANOG蛋白在宫颈癌、CINⅢ和正常宫颈组织中的表达 例(%)Tab 1 Expression of NANOG protein in cervical cancer，CINⅢ and normal cervical tissue cases(%)

表2 NANOG蛋白与临床资料相关性分析Tab 2 Correlation between NANOG protein expression and clinical data

3 讨论

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)是存在于肿瘤组织中具有干细胞特性的细胞亚群，被认为是肿瘤发生发展的根源［7］。一个肿瘤干细胞能够产生整个肿瘤组织中不同分化阶段的所有细胞。研究人员已在白血病、黑色素瘤、神经系统肿瘤等多种恶性肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞［7－9］。

NANOG是胚胎干细胞中特异表达的基因［10］，是维持干细胞自我增殖和多功能性的关键基因。本实验表明，正常宫颈组织、CINⅢ和宫颈癌组织中NANOG表达的阳性率分别为0，70%，90%，阳性表达率依次升高，差异具有统计学意义。同时，在30例宫颈癌组织中NANOG表达结果的强弱与临床分期及有无淋巴转移无关，但与组织学分级有关。这说明胚胎干细胞是否分化依赖于NANOG表达量的高低。NANOG的表达水平越高，肿瘤组织发生分化的可能性越小，由此推测，NANOG的表达与癌症的发生、发展有关。同时本实验也表明，NANOG蛋白在宫颈癌组织中呈现出高表达，其阳性细胞多呈现出点状聚集，仅有少数呈灶状聚集，同时NANOG阳性细胞多位于癌巢和间质的交界处。在CIN中，NANOG蛋白呈点状核表达，主要位于基底膜上皮细胞，而在正常宫颈组织中，NANOG蛋白则无阳性表达。这一现象同样符合肿瘤干细胞理论中肿瘤干细胞仅仅是肿瘤组织中的小部分。

综上所述，NANOG在宫颈癌及CIN组织中均有表达，同时在宫颈癌及CIN中的表达量明显高于正常宫颈组织，但不能为宫颈癌的临床分期及有无淋巴结转移提供诊断依据，仅表明与宫颈癌组织分级有关。因此NANOG可作为宫颈癌的一个敏感性、特异性的标志和治疗靶点，同时对揭示肿瘤的来源和指导肿瘤的防治具有重要意义。但它在肿瘤干细胞中通过调控哪些通路及转录因子从而发挥重要作用还有待于进一步研究。

［1］ Chamber I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells［J］.Cell，2003，113(5):643 －648.

［2］ MitsuiI K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells［J］.Cell，2003，115(5):631 －636.

［3］ Hoei H，Ansen C，Almstru PK，et al.Stem cell pluripotency factor NANOG is expressed in human fetal gonocytes，testicular carcinoma in situ and germ cell tumours［J］.Histopathology，2005，47(1):48－49.

［4］ Hart AH，Hartley L，Ibrahim M，et al.Identification，cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human［J］.Dev Dyn，2004，230(1):187 －188.

［5］ Rodda DJ，Chew JL，Lim LH，et al.Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2 ［J］.Biol Chem，2005，280(26):24731－24737.

［6］ Tang Y，Kitisin K，Jogunoori W，et al.Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-b and IL-6 signaling［J］.PNAS，2008，105(7):2445 －2450.

［7］ Marotta LC，Polyak K.Cancer stem cells:a model in the making［J］.Curr Opin Genet Dev，2009，19(1):1 －7.

［8］ Schattonc T，Murphy GF，Frank NY，et al.Identification of cells initiating human melanimas［J］.Nature，2008，451(7176):345－349.

［9］ Fukaya R，Ohta S，Yamaguchi M，et al.Isolation of cancer stemlike cells from a side population of a human glioblastoma cell line，SK-MG-1［J］.Cancer Lett，2010，291(2):150 －157.

［10］ Hattori N，Imao Y，Nishino K.Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells［J］.Genes，2007，12:387－396.