转化生长因子－β1、Smad3、结缔组织生长因子在慢性萎缩性胃炎中的表达及意义

刘 欣， 张晓敏， 董 蕾 (西安交通大学医学院第二附属医院消化内科， 西安 710004)

慢性萎缩性胃炎是消化系统的常见病及多发病，合并肠化及不典型增生被称为癌前疾病，目前尚无有效的治疗手段，因此对其病因及发病机制的研究可为其防治提供新思路。萎缩性胃炎的病理改变为固有腺体减少并被纤维组织、纤维肌性或肠上皮化生、假幽门腺替代。幽门螺杆菌(Helicopter pylori，Hp)感染可以引起炎性细胞浸润，破坏黏膜腺体引起萎缩［1］。而转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是近年来发现的具有促纤维化作用的重要因子，CTGF主要通过Smads通路进行信号转导，其中 Smad3 蛋白是必需的［2，3］。本实验主要研究在萎缩性胃炎中 TGF-β1、Smad3、CTGF的表达变化，同时探讨Hp感染对萎缩性胃炎的发生及上述因子的影响。

1 资料与方法

1.1 病例资料 收集2010-12～2011-07经我院胃镜检查诊断为慢性胃炎患者128例，其中男性67例，女性61例，年龄17-74岁，平均年龄(55.1±12.3)岁。所有患者除外其他器质性病变，检查前1周内未服用抗生素、质子泵抑制剂及黏膜保护剂。

1.2 组织处理 分别在胃窦及胃体大小弯侧各取2块组织，固定于10%福尔马林溶液，包埋于石蜡中，切片后行HE染色及免疫组化检测。

1.3 胃炎分型 根据2006年《慢性胃炎共识意见》［4］对HE标本进行病理分型。

1.4 幽门螺杆菌测定 幽门螺杆菌(Hp)经13C呼气试验及快速尿素酶法检测，其中任一项阳性为Hp阳性，两项均阴性为Hp阴性［5］。

1.5 免疫组化法检测TGF-β1、CTGF、Smad3 采用免疫组化 SP法。一抗转化生长因子-β1(bs-0103R)、Smad3(bs-3484R)、结缔组织生长因子(bs-0743R)购于北京博奥森公司，采用1∶100浓度稀释。SP检测试剂盒(SP-9001)，DAB(ZLI-9032)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。步骤如下:石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后，置于枸橼酸钠修复液(0.01 mol/L，pH 6.0)中，经高压锅加热进行抗原修复。加入3%过氧化氢溶液15 min，以消除内源性过氧化物酶活性，切片滴加一抗后4℃冰箱过夜。次日切片37℃复温30 min，PBS冲洗后按说明书滴加SP试剂，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.6 免疫组化结果判定 采用综合评分法［6］，根据阳性细胞数及细胞着色深度分别记分。每片随机观察5个具有代表性的高倍视野，计数500个细胞中染色阳性数，按切片中阳性数量百分比评分:＜5%为0分;6%-25%为1分;26%-50%为2分;51%-75%为3分;76%-100%为4分。以细胞质或细胞膜被染成棕黄色为阳性细胞，按切片中细胞着色深浅评分:细胞无着色为0分;浅黄色1分;棕黄色2分;棕褐色3分。两者分数相乘为最后积分:0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。

1.7 统计学分析 应用SPSS12.0统计学软件进行统计学分析，组间采用Wilcoxon秩和检验、χ2检验进行差异性分析，Spearman秩相关进行相关性分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃炎分型 128例慢性胃炎患者中，其中萎缩性胃炎75例，非萎缩性胃炎53例。萎缩性胃炎中，其中胃窦萎缩66例，胃窦合并胃体萎缩9例。胃窦轻度萎缩36例，中-重度39例。胃窦萎缩并肠化15例，并不典型增生6例。

2.2 Hp感染率 75例萎缩性胃炎中Hp阳性者51例，感染率为68.1%;53例非萎缩性胃炎Hp阳性者26例，感染率为49.1%，两者Hp感染率之间差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 胃窦黏膜中 TGF-β1、CTGF、Smad3 的表达TGF-β1主要表达于胃窦部黏膜浅层的单核细胞中，CTGF主要表达于单核细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞及平滑肌细胞中，Smad3主要表达于单核细胞及固有腺细胞中。

TGF-β1在萎缩组中的表达强度与非萎缩组相比差异有统计学意义(P＜0.05);在萎缩组中Hp阳性及阴性组间表达强度有统计学差异(P＜0.05)。在非萎缩、轻度萎缩及中-重度萎缩组间表达强度比较均有统计学意义(见表1)。

CTGF在萎缩组中的表达强度与非萎缩组相比差异有统计学意义(P＜0.05);在萎缩组中Hp阳性及阴性组间表达强度有统计学差异(P＜0.05)。在非萎缩、轻度萎缩及中-重度萎缩组间表达强度比较结果见表2。

Smad3在萎缩组中的表达强度与非萎缩组相比差异有统计学意义(P＜0.05);Smad3在萎缩组中Hp阳性及阴性组间表达强度无统计性差异(P＞0.05)。非萎缩、轻度萎缩及中-重度萎缩组间表达强度比较均无统计学差异(见表3)。

表1 各组胃窦黏膜TGF-β1表达强度的比较 (例)Tab 1 Expression of TGF-β1 in gastric antral mucosa in different groups (cases)

表2 各组胃窦黏膜CTGF表达强度的比较 (例)Tab 2 Expression of CTGF in gastric antral mucosa in different groups (cases)

表3 各组胃窦黏膜Smad3表达强度的比较 (例)Tab 3 Expression of Smad3 in gastric antral mucosa in different groups (cases)

胃窦萎缩合并肠化15例，TGF-β1表达阳性(++)及强阳性(+++)者为11例，CTGF表达阳性(++)及强阳性(+++)者为13例，表达强度均有增高趋势，但因例数较少，未能进行统计学分析。

胃窦萎缩合并不典型增生6例，TGF-β1表达阳性(++)及强阳性(+++)者为5例，CTGF表达阳性(++)及强阳性(+++)者为4例，表达强度均有增高趋势，但因例数过少，未能进行统计学分析。

2.4 胃体黏膜中 TGF-β1、CTGF、Smad3 的表达TGF-β1、Smad3、CTGF 主要表达于固有腺细胞中，胃体萎缩中可见间质TGF-β1、Smad3、CTGF表达增多。

2.5 萎缩性胃炎中 CTGF与 TGF-β1及 Smad3的相关性分析 萎缩性胃炎中CTGF与TGF-β1表达呈正相关(r=0.532，P ＜0.05)，TGF-β1 与 Smad3 表达呈正相关(r=0.296，P ＜0.05)，CTGF 与 Smad3 表达呈正相关(r=0.331，P ＜0.05)。

3 讨论

炎症可以使结缔组织通过间质细胞增生、迁移、积聚及细胞外基质沉积而发生纤维化反应。尽管不同器官的慢性炎症由不同原因引起，但是都可以使巨噬细胞、粒细胞、T细胞等炎性细胞浸润及促炎因子释放，最终导致局部成纤维细胞增生，同时协同上皮细胞互相作用进而分化成肌成纤维细胞，这种细胞是细胞外基质重要来源［7］。

TGF-β1是致组织纤维化的重要因子，在结缔组织纤维化、病理性瘢痕形成、以及肝、肾、心、肺等多种组织器官纤维化疾病中表达增加［7］。TGF-β1、CTGF是成纤维细胞的促有丝分裂原及趋化因子，可以刺激成纤维细胞转化为激活的肌成纤维细胞，进而转化为平滑肌细胞。萎缩性胃炎同样存在炎性细胞浸润，间质纤维组织及纤维肌性组织增生。有研究发现TGF-β1可能促进萎缩性胃炎的发生，并且在Hp相关性胃炎中表达增高［8，9］。CTGF是近年来发现的介导TGF-β1促纤维化作用的一个重要的下游因子，临床和实验研究均已证实CTGF的表达与纤维化程度积分呈显著正相关［10］。CTGF主要通过Smads通路进行信号转导，其中受体调节性Smad3 蛋白必不可少［2，3］。我们的研究发现 CTGF及TGF-β1随着萎缩程度的加重，阳性细胞数增多，并且在Hp阳性组间更为显著，说明TGF-β1及CTGF可能参与胃黏膜萎缩的进程。由于TGF-β1具有多种生理学效应，如参与自身免疫及炎症反应，调控肿瘤生长等，因此，针对纤维化疾病，TGF-β1阻滞剂的应用很难避免对机体的这些生理效应产生影响。许多研究发现CTGF可以介导TGF-β1诱导的纤维化反应，但是CTGF是否参与TGF-β1介导的免疫调控及炎症反应，Kunzmann等［11］对此做了回答，他们发现CTGF对TGF-β1诱导的CD4 T淋巴细胞增殖毫无影响，但是关于自身免疫的研究还有大量的工作需要完成。Mori等［12］在小鼠的皮肤纤维化模型中发现，连续皮下注射7d TGF-β1，仅仅可以引起短期的纤维化组织增生，而同时注射CTGF则可以引起持续稳固的纤维组织增生。因此，胃黏膜中TGF-β1及CTGF的表达上调，可能会诱发持久的纤维组织增生，特异性的抗纤维化治疗(CTGF的拮抗剂等)可能会阻止萎缩性胃炎的进展，尚需进一步建立动物模型进行观察。

本研究发现Smad3蛋白在非萎缩及萎缩组间有统计学差异，并且Smad3与TGF-β1及CTGF表达呈正相关，说明Smads通路参与胃内TGF-β1介导的免疫抑制及纤维化反应。但是Smad3蛋白在萎缩组间无统计学差异，考虑为Smad3蛋白对TGF-β1起到负反馈调节作用，同时CTGF在中-重度萎缩性胃炎中明显增加，提示CTGF的生物学效应除经Smads通路产生，尚存在其他的信号通路，如Ras/MEK/Erk、蛋白激酶C和酪氨酸激酶等，从而促进胃内间质纤维化发生［7，13］，其作用机制如何，Smads通路与其他通路的交叉等等尚需进一步研究。

Hp感染可以引起炎性细胞浸润，破坏胃黏膜腺体，Hp感染的黏膜层内发生组织损伤-修复-再损伤-再修复的炎症过程，损伤黏膜由纤维化或肠化组织修复重建，同时胃黏膜的萎缩也开始发生，根除Hp后纤维化及肠化的可逆性证据很少［14］。流行病学发现有Hp感染者较无Hp感染者萎缩性胃炎的发病率升高，我们的研究资料也发现萎缩性胃炎较非萎缩性胃炎Hp的感染率高，差异有统计学意义，说明Hp是萎缩性胃炎的重要致病因素，另外，胆汁反流、宿主遗传性，获得感染时的年龄，宿主酸分泌状态以及高盐、低维生素饮食等因素也可能导致萎缩性胃炎的发生［15］。Hp感染后上皮细胞主要通过上调Th1细胞参与免疫反应，表现为黏膜组织内活化的CD4+细胞浸润，Th1型细胞因子IL-1、TNF-α、TGF-β 及 IFN-γ 增加［16］。TGF-β1 对黏膜炎症具有负性调节作用，我们的研究结果也发现在萎缩性胃炎中TGF-β1、CTGF表达的细胞在 Hp阳性组中明显增多，因此早期根除Hp可能预防萎缩性胃炎的发生及进展。

本研究中萎缩性胃炎胃体萎缩只占有12%，说明我国萎缩性胃炎以胃窦萎缩为主。Fujisawa等［17］研究发现胃黏膜的主细胞及壁细胞表达TGF-β1。胃体部 TGF-β1、Smad3、CTGF 在固有腺细胞中有弱阳性表达，说明上述因子少量表达即可确保结缔组织的生理性更新。动物实验发现胃壁细胞表达CTGF参与局部创伤的修复及肉芽形成的调节，抑酸治疗后可增强这一代偿机制［18］。这与我们在胃体萎缩标本中发现除间质细胞外，胃固有腺细胞较多表达CTGF一致，但尚需增加病例数在胃体萎缩中进一步研究。

值得注意的是TGF-β1/Smad3/CTGF在胃癌细胞及癌前病变中也有表达［19，20］，在肿瘤早期具有抑制肿瘤增殖的作用，但晚期开始与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、临床预后密切相关，其具体的机制目前尚不清楚，我们的研究发现TGF-β1、CTGF在非化生性萎缩性胃炎、化生性萎缩性胃炎及不典型增生组中表达强度有增高的趋势，但例数较少，还有待于进一步在癌前病变及胃癌中进行相关研究。

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