Patched－1和Gli－1在尖锐湿疣皮损中的表达及意义

李 萍，冯世军，朱文胜，艾东方，杨秀芳

(1沧州市中心医院，河北沧州061001;2青县人民医院)

尖锐湿疣(CA)是由人乳头瘤病毒(HPV)感染所致的一种性传播疾病，少部分可以癌变。由于其发病部位及顽固性常给患者带来巨大的心理压力和治疗费用增加，因此进一步研究其致病机理尤为重要。CA是角质形成细胞过度增殖为主要组织病理学表现的良性病变，已证实多个信号通路与之相关，MAPK途径及 STAT途径研究较多，但 Hedgehog (Hh)信号通路与 CA的关系国内外鲜有报道。2009年5月～2010年12月我们通过检测Patched-1 (Ptch-1)和Gli-1在CA皮损中的表达，探讨Hh信号通路与CA的关系，为CA的发病机理提供某些理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 CA患者组织标本均来自沧州市中心医院皮肤科门诊，每例均经过临床及组织病理确诊，且所有患者取材前未做过治疗，共58例，其中男32例、女26例，年龄18～62岁、平均28.2岁，病程3 d～9个月。正常对照组来源于我院整形美容科手术切下的正常人健康皮肤，均无任何系统性疾病及皮肤疾病，共15例，其中男6例、女9例，年龄

17～51岁、平均30.8岁。

1.2 主要试剂 Ptch-1和Gli-1抗体均为美国SantaCruz公司产品，两种抗体工作浓度皆为1∶200。免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3 实验方法 切取的皮损及正常组织均常规给予10%甲醛固定石蜡包埋，切成4 μm厚的切片，石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2消除内源性过氧化酶活性，高压锅抗原修复，滴加正常兔血清封闭液，室温孵育10 min，加入一抗(Ptch-1和Gli-1抗体)工作液，37℃孵育2 h，滴加生物素标记二抗、37℃孵育10～30 min，滴加链霉亲和素-过氧化物酶复合物，37℃孵育10～30 min，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，乙醇脱水，中性树脂封片。封片后显微镜下观察，图像分析、拍照。阴性对照标本用PBS代替一抗，用预实验中证实为对本实验所用抗体呈阳性反应的基底细胞癌连续切片作阳性对照。

1.4 结果判定标准 免疫组化结果示显微镜下Ptch-1和Gli-1阳性染色呈黄色或棕黄色颗粒，位于胞质或胞膜中。随机选取4个非连续的高倍镜视野计数，采用阳性细胞数和染色强度两项综合来计算评分［1］:①阳性细胞计数:无阳性细胞为0分，阳性细胞数＜10%为1分，阳性细胞数10%～50%为2分，阳性细胞数＞50%为3分;②染色强度依据深浅记分:阴性为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分。上述两项相加即为着色程度积分:结果是得0～2分为阴性，得3～6分为免疫组化染色阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理分析，计数资料采用χ2检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

15例正常对照组皮肤中Ptch-1阴性为13例，阳性为2例;58例CA患者皮损中Ptch-1阴性21例，阳性为37例(χ2=12.20，P＜0.05)，见封三图7、8。15例正常对照组皮肤中Gli-1阴性为14例，阳性为1例;58例CA患者皮损中Gli-1阴性19例，阳性者为39例(χ2=17.65，P＜0.05)，见封三图9、 10。

3 讨论

Hh信号通路是1980年由 Nusslein-Volhard和Wieschaus通过基因突变筛选首先在果蝇中发现的，并于1992年克隆成功。它是一个高度保守的调控胚胎发育的信号通路，调控着神经、循环、呼吸、消化、生殖系统、皮肤及其附属器等多个器官和组织的发育。Hh信号通路主要由分泌型信号糖蛋白跨膜蛋白受体Ptch和Smo组成的复合物以及下游转录因子Gli蛋白组成。Hh与膜受体Ptch结合后，解除Ptch对Smo的抑制，Smo进入胞质，将信号下传，激活锌指转录因子Gli，后者进入细胞核，直接激活并启动下游目的基因的表达［2］。多项研究表明，Hh信号通路异常激活可以引起多种肿瘤(如神经管细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等)的形成及发展［3～7］。

本实验之所以选用Ptch-1和Gli-1作为研究对象，是因为在既往的多种实验中已经证实二者是Hh信号通路中关键作用的结合点之一。Kinzler等［8］人首次在神经胶质瘤中发现Gli表达异常升高。Ma等［9］研究发现原发性胃癌中存在Ptch-1和Gli-1的过度表达，利用特异性抗体阻断Hh信号通路后可以抑制胃癌细胞的生长。Oro等［10］通过转基因小鼠模型过度表达Gli或Shh可诱导类似于基底细胞癌的形成。刘瑛等［11］采用免疫组化和原位杂交方法发现在鳞状细胞癌(scc)皮损中Hh信号通路中的Ptch-1和Gli-1蛋白水平及mRNA的表达均明显增加。

近年研究发现不但在角质形成细胞异常分化增殖形成的恶性上皮细胞肿瘤如基底细胞癌、鳞状细胞癌中存在Hh信号通路过度表达，而且在以角质形成细胞增殖为主要病理特征的炎症性皮肤病(如银屑病)中亦存在表达增加［12］。CA组织病理表现为角质形成细胞过度增殖为主的棘层肥厚和乳头瘤样增生。本次试验采用免疫组织化学方法发现Ptch-1和Gli-1信号分子在CA过度增殖的角质形成细胞中的呈高表达，进一步证明了Hh信号转导通路在CA皮损中是处于激活状态的，且是否表达与患者性别无明显相关性。总之，本实验为进一步揭示CA发病机制提供了实验依据，也为今后CA的治疗提供了新的思路。

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