iPSCs临床应用安全性的研究进展

蒋而康

（安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036）

iPSCs临床应用安全性的研究进展

蒋而康

（安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036）

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是被重新编程的、具有多能性的成体细胞。最近的研究证实，iPSCs能够达到与胚胎干细胞同样的全能性。源于成体的iPSCs对药物或毒性筛选、医疗研究以及疾病专一性治疗提供了极其有价值的细胞来源，然而，在应用于临床之前，必须克服潜在的风险，包括iPSCs诱导中病毒的整合、基因的改变。iPSCs潜在的风险涉及外源因子的转入、目标细胞的改变及诱导因子的表达和重新激活等。本文回顾iPSCs的应用前景和面临的挑战，同时对诱导安全性iPSCs的方法进行了讨论。

诱导多能性干细胞；临床应用；安全性

在2006年，Yamanaka等首次通过表达4种外源转录因子，Oct4，Sox－2，Klf4和c－Myc将小鼠成纤维细胞重新编程逆转成为多能性干细胞，并将该类干细胞称为诱导多能性干细胞［1］。在此之后的5年，全世界的研究者对iPS领域的研究热情高涨。继从小鼠成体细胞诱导产生iPS细胞后，研究者从人的成体细胞也成功诱导得到人的iPS细胞。iPS细胞与胚胎干细胞非常相似，能够分化成内、外、中胚层来源的任一种成体细胞，而且不涉及胚胎毁损等伦理学问题，同时个体特异来源的iPS细胞在移植时不会产生免疫排斥。利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射方法获得了存活并具有繁殖能力的小鼠，首次证明iPS细胞具有与胚胎干细胞相同的全能性［2］。因此，iPS细胞拥有无限的应用潜力。

1 疾病专一性iPSCs用于医学研究和疾病治疗

iPSCs最大价值在于它的个体特异性，来自病人自身的体细胞被重编程为iPS细胞，继而分化产生病人专一的细胞、组织和器官用于病人的移植治疗。疾病专一性iPSCs（Disease－specific iPSCs）为在体外再现和研究病理过程提供了一个前所未有的机会。几个研究组已经成功获得多种病人iPSCs，例如腺苷脱氨酶－重症联合免疫缺陷病（ADASCID）、III型高雪病（gaucher disease type III）、1型糖尿病（Juvenile diabetes mellitus）、帕金森病（Parkinson disease）、亨廷顿病（Huntington disease）、唐氏综合征（Down Syndrome）等疾病专一性iPS细胞［3］。以患者或疾病特异性的iPS细胞为对象的实验性用药，能筛选出针对个体或疾病有效的药物，为药物的筛选和疾病的治疗提供了一种全新的探索模式。通过iPSCs模型，可以详细研究疾病相关的表型起源。

显而易见，iPSCs技术的长期目标在于细胞治疗。研究者希望病人专一性的iPSCs能够治愈或减轻某种功能减退的疾病的症状，同时无需免疫抑制药物。来自病人的iPSCs在临床应用前，需要先矫正作为病因的遗传改变。在人源化的小鼠模型采用iPSCs来治疗镰刀状贫血症。野生型的β球蛋白β－globin基因通过同源重组取代缺陷基因，移植基因矫正的iPSCs衍生的造血前细胞成功地缓解了患病动物贫血的症状。用携带野生型基因的慢病毒（lentivirus）转染来自范可尼贫血症（Fanconi anemia，FA）患者的成纤维细胞能够产生iPSCs，并且能够分化成表型正常的脊髓的以及血液中的造血前细胞［4］。但是，基因修饰、插入突变和非内生基因的表达可能阻止iPSCs的临床应用。最近在iPSCs和h ESCs研究中，采用锌指核酸酶通过同源重组可以高效率地矫正遗传缺陷，同时无须使用病毒，这可能是一个矫正人的细胞中内在的遗传缺陷的理想方法。以上的研究为病人专一性iPSCs用于治疗疾病奠定了基础［4］。然而，在个体专一性iPS细胞应用于临床前还有许多障碍需要克服，其中之一是iPS细胞的安全性。

2 iPSCs安全性研究的新发现

iPSCs临床应用的诱人前景使得对其进行核型分析成为一个重要的研究课题。Yu.M.Minina等［5］通过染色体核型分析和荧光原位杂交发现，在iPSCs细胞系观察到X染色体单体，其模式染色体数为39。在研究的2个iPSCs细胞系中均呈现染色体不稳定性，而且在其中的1个iPSCs细胞系我们检测到染色体重排和染色体片段的存在。研究提示对iPSCs进行细胞遗传学评估的重要性。Veronica Ramos－Mejia等［6］的研究表明，在诱导产生iPSCs后，如果持续表达外源的诱导因子，可能导致细胞的基因组不稳定性，如实验产生的人iAND－4 iPSC细胞系为的非整倍体细胞系，其代表性核型是（47，XY，＋1，＋5，－17）。

由于成体细胞的起源，诱导的人iPSCs细胞应有正常的二倍体基因组，而获得性的染色体畸变尚未充分评估。Yoav Mayshar［7］等通过核型分析、比较基因组杂交（CGH）等方法研究了66个人的iPSCs（HiPSC）和38个人的胚胎干细胞（HESC）的基因组完整性。结果提示，有相当多的细胞系带有全部或部分染色体畸变，其中一部分在染色体水平得到验证。几种畸变来自细胞培养，其它的可能来自作为iPSC来源的成体细胞。实验也揭示早期的非整倍体HiPSCs细胞，提示在细胞重新编程中有相当大的选择性压力。分析表明，在HiPSCs细胞trisomy 12（chr12三体）有很高的发生率，导致细胞周期相关基因有更高的丰度。这种非整倍性可能限制HiPSCs细胞的分化潜力，并增加其致瘤性。

3 导致iPSCs遗传不稳定性的因素

3.1 iPSCs诱导方法产生遗传不稳定性

到目前为止，大部分iPSC细胞系是用反转录病毒和慢病毒载体整合基因组［8］，导入重编程因子（e.g.OCT4，SOX2，KLF4，c－MYC）。虽然，在iPSC诱导完成后，反转录病毒导入的基因处于表观遗传的沉默状态，但是，这种方法产生的iPSC中的转基因可能在病人体内重新激活，导致肿瘤发生和恶化的严重风险，从而影响临床应用。同时，基因插入引起的突变也可能导致体内移植时细胞转化和恶化的风险。

3.2 细胞重编程因子影响iPSCs的遗传不稳定性

Oct－3／4，Sox－2，Klf－4和c－Myc四因子成功用于从人、鼠成体细胞产生iPS细胞［1］。总体上说，Oct－3／4和Sox－2是诱导干细胞的关键因子，而Klf－4和c－Myc有助于增加诱导效率。然而，这些重编程因子都是肿瘤相关性因子，在这些因子驱动下产生的iPS细胞可能存在安全隐患，具有致瘤性。从安全的角度看，从成体产生iPS细胞应该采用最少量的，严格控制的，完全可逆的，充分了解的的诱导因子。

4 诱导产生安全iPSCs的方法进展

在体外诱导iPSCs产生自体移植的细胞用于疾病治疗具有重要的临床价值。然而，在iPSCs应用于临床前需要考虑一些关键的问题。一个关键的挑战是是找到新方法使得对基因组的修饰最小。

既然导致iPSCs产生遗传不稳定性的因素主要有2种，即基因插入引起的突变和诱导因子本身的致瘤作用，那么，产生安全iPSCs的策略就在于2个方面，（1）减少直至没有基因整合的发生；（2）减少直至没有细胞重编程基因的使用。

4.1 减少iPSCs的细胞重编程因子

不使用致癌因子如c－Myc和Klf4诱导iPSCs是一个重要的进展［8］。近来，在无Myc和Klf4条件下，采用其他的因子组合从小鼠和人成纤维细胞成功诱导出多能干细胞。然而，病毒导入的其他基因激活也同样可能导致肿瘤。事实上，在多种肿瘤中也发现其他诱导因子如Oct4，Sox2和Nanog的高水平的表达，同时外源表达Oct4能够诱导上皮组织的增殖。减少诱导因子或病毒载体将显著降低反转录病毒插入突变。几个研究组已经证明用单个病毒载体导入多个基因对基因组的影响程度最小。这种方法运用一种慢病毒载体，它可以从一个启动子表达多顺反子mRNA，其原理在于在诱导因子编码序列之间加入2A自我切割的肽段或联用内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）和2A肽段。令人吃惊的是，每个研究都证明单个病毒足够将胚胎和成体细胞诱导成多能干细胞，但是使用慢病毒和反转录病毒带来的转基因激活和插入诱变仍然存在。而且，当iPSCs衍生细胞移植到病人体内时，残存的转基因表达可能抑制iPSCs的分化潜力，并导致很高的致瘤风险。从根本上说，如果要产生安全的用于临床的细胞，没有病毒整合的iPSCs细胞是必须的。

4.2 通过病毒整合诱导iPSC，随后切除整合的基因

通过基因组整合转录因子，随后切除插入的基因，实现了这一目标。几个研究组报道了通过质粒和慢病毒携带4种因子整合进基因组诱导产生iPSCs，随后使用Cre－lox介导的剪切（Cre－lox mediated excision）从基因组中清除转基因序列［9］。虽然这种方法的进展是显著的，其局限在于不能清除残存的载体序列，因此仍然具有插入诱变的风险。目前，研究者已经绕过这一问题，使用piggy Bac转座子（transposon）引入诱导因子。这个系统来自蛾（moth）的DNA转座子，它在哺乳动物和小鼠中具有很高的活性。该转座子已被用来导入基因、诱导突变，而且它不象其它的转座子，在剪切后不留下任何的残余序列。这样，以单个载体表达系统和piggyBac转座子从MEFs诱导iPSCs，再通过转座子酶（transposase）清除载体和转基因序列。重要的是，这些研究也证明体外产生多能干细胞无需持续表达外源诱导因子。

4.3 无病毒整合法产生iPSCs

最近一个产生iPSCs的策略是利用非整合病毒或质粒导入诱导因子。Hochedlinger与合作者用腺病毒瞬时表达Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc因子，诱导鼠的成纤维细胞和肝细胞成为iPSCs，其过程中无病毒整合发生［10］。研究也显示，以多个质粒或者表达多顺反子的单个质粒为载体，通过诱导因子Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc能产生无病毒整合的小鼠iPSCs。近期，通过非整合的附加体质粒成功产生完全无载体或转基因序列整合发生的人iPSCs。虽然用这些技术成功产生无外源基因整合的iPSCs，但诱导效率很低，对于腺病毒介导的细胞重编程，需要几轮转染才能完成。因此，为了获得无外源基因整合的iPSC细胞系，需要建立大量的侯选细胞株。而且，用这种方法产生的iPSCs需要进一步评估，以排除可能的病毒整合，因为有研究表明，即使用非整合的载体，仍有低频率的整合发生。当然，这些研究还是将人的iPSCs向临床应用推进了一步。

4.4 基于蛋白重新编程产生iPSC

一些蛋白能够被细胞摄取，这一现象导致发现蛋白转化的结构域，即所谓的“转化肽”或“细胞穿透肽”（transduction peptides or cell－penetrating peptides）。当与其它蛋白融合时，这些肽段能携带目的蛋白进入细胞，尽管效率有差异。因此，预期蛋白转化是调控细胞命运的、无遗传干预的另一条途径。研究最广泛的三个肽是果蝇的antennapedia peptide，单纯胞疹病毒蛋白VP22（herpes simplex virus VP22）和HIV TAT protein transduction mo－tif［11］。另一方面，能够将蛋白带进细胞并转化的非肽化合物可能取代穿膜肽。研究报道用细胞穿透肽（cell－penetrating peptide（CPP））融合转化4因子，从小鼠和人的成纤维细胞产生稳定的iPSCs。然而，以上2种方法产生iPSCs的效率都很低，需要进一步优化。特别是单个因子的浓度必须测定以接近正常细胞内生的水平。

4.5 化学因子法诱导多能干细胞

几个研究组报道显示联用基因转化和化学因子能诱导产生多能干细胞。这些特定的因子能取代致瘤的因子和增加诱导的效率。例如，kenpaullone，它能替代Klf4诱导小鼠的iPSCs。化学因子如组蛋白甲基转移酶抑制剂（G9a histone methyltransferase）BIX－01294、DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）抑制剂5－aza－2′－deoxycytidine（5－azadC）和组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂valproic acid（VPA），显著提高神经干细胞和小鼠的成纤维细胞的诱导效率［12］。这些结果表明，高通量筛选能够激活多能性转录网络或者抑制多能性的负调控的外源因子和小分子，最终可能找到完全以化学因子来诱导的iPSCs。与常规的诱导方法一致，这些化学因子在细胞内作用的靶位与机制必须全面研究，然后才能应用于临床。

4.6 MicroRNAs诱导多能干细胞

MicroRNAs（miRNAs）是基因表达的重要调节子（regulators），miR－290 cluster的表达占鼠的ESCs中全部miRNA表达的70%，而miR21和let－7家族是胚胎成纤维细胞中最丰富的miRNAs。几种miRNAs包括mir－21，mir－22和let7在干细胞的分化中起作用。这提示人为表达ESC专一性的microRNAs或抑制分化相关的microRNAs可能改变细胞的命运。与此一致，用miR－302（h ESC中miR－290的同功miRNA），转化的癌细胞显示上调许多关键的ESC标记物，包括Oct4，Sox2，and Nanog以及SSEA－3和SSEA－4。而且，这些细胞的基因组表现出与胚胎干细胞相似的高度的去甲基化状态。miR－291－3p，miR－294和miR－295增加用Oct4，Sox2和Klf4将小鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞的效率［13］。这个研究也表明，miRNAs能够替代c－Myc，甚至能形成更均一的iPSCs。这种方法的一个的难题在于难以控制导入细胞的miRNA数量。当然，采用miRNA，不管单独使用，还是与无病毒的诱导方法共同作用，都能显著提高iPSCs的安全性。

5 iPSCs安全性展望

在体外诱导iPSCs产生自体移植的细胞用于疾病治疗具有重要的临床价值。然而，在iPSCs应用于临床前需要考虑一些关键的问题。一个关键的挑战是是找到新方法使得对基因组的修饰最小。不需要胚胎产生的人iPSCs已经开始应用于体外疾病模型以及多能性机理的研究，它最有价值的用途在于细胞的替代治疗，因为病人自身细胞重新编程产生的细胞不会产生免疫排斥。这些疾病包括帕金森，SCID，镰刀状贫血症和退行性疾病等。如上所述，使用iPS细胞的安全性问题依然存在，解决这些问题是iPSCs临床应用的基本前提。许多产生iPSCs的方法都涉及基因插入诱导的突变。虽然在细胞重新编程后，转入的基因表现为沉默，但这些原癌因子可能能重新激活而对组织有损害。对于成功重新编程得到的细胞，遗传的或表观遗传的改变是否必不可少尚未可知，而且这些改变是否会带到分化的细胞中，也是未知数。当然，随着诱导iPSCs的技术发展，细胞重编程机理的进一步阐明，将有可能产生更安全的iPSCs，并最终应用于临床。

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Progress in Safe Induced Pluripotent Stem Cells for Clinical Applications

JIANG Er－kang
（SchooloftheLifeScience，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China）

Induced pluripotent stem cells（iPSCs）are somatic cells that have been reprogrammed to a pluripotent state.Recent researches confirmed that iPSCs can attain true pluripotency that is similar to that of ES cells.iPSCs from somatic cells provide an invaluable resources for drug or toxicology screening，medical research，and patient－specific cell therapy.However，there are currently a number of obstacles including virus integration and the genetic alteration of iPSCs that will need to be resolved before these cells may be considered safe for clinical applications.Potential risks are involved in the delivery of the endogenous factors，alterations in target cells，the cellular effects of the expression and reactivation of the factors that induce pluripotency.In this review，the potential and challenges of iPSC research are described，followed by a discussion of the safety concerns and how these concerns are currently being addressed.

Induced pluripotent stem cells（iPSCs）；clinical applications；safe

R4

A

1674－2273（2012）03－0091－04

2012－01－10

安徽农业大学稳定和引进人才科研资助项目。

蒋而康（1970－），男，安徽金寨人，博士，安徽农业大学生命科学学院教师，研究方向：细胞生物学。