NF-κB decoy寡核苷酸转染对结肠癌细胞NF-κB DNA结合活性的影响

徐晓云，李冬斌，李 彬

(1河北医科大学第二医院，石家庄050000;2河北医科大学)

核转录子κB(NF-κB)在炎症性肠病(IBD)的发生发展过程中是一种重要的转录因子。2007年3月～2008年12月，本研究通过合成NF-κB decoy寡核苷酸(ODNs)并转染，对LPS诱导结肠癌SW480细胞NF-κB的活化进行干预，用TransAMTM法测定了细胞核NF-κB p65的DNA结合活性，观察其对结肠癌细胞NF-κB DNA结合活性的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料和试剂 结肠癌SW480细胞株购自上海麦莎生物科技有限公司，大肠杆菌(E.colioll:B4)购自Sigma公司。Trizol试剂以及阳离子Lipofectamine2000脂质体购自美国 Invitrogen公司。RPMI1640购自美国Gibco公司，BCA-Protein Assay kit购自晶美生物工程有限公司，TransAM NF-κB p65 kit购自晶美生物工程有限公司，兔抗人NF-кB p65单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 ODNs 序列设计 参考文献［1，2］设计 ODNs 序列，由上海博亚生物技术有限公司合成。NF-κB decoy ODNs:5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'和3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5';Scrambled decoy ODNs:5'-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-3'和3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5'。

1.3 细胞培养 SW480细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。培养液含10%热灭活小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基。

1.4 细胞转染 每次转染前退火，将互补的两条单链ODNs合成双链ODNs(ds-ODNs):将等摩尔的互补单链脱氧ODNs混合，98℃水浴5 min，缓慢降至室温，形成 ds-ODNs，－20℃保存。根据 Lipofectamine2000试剂盒说明书处理 ds-ODNs。细胞随机分为5组。对照组:不作处理;脂多糖(LPS)组:LPS(10μg/L)刺激3 h;NODN组:LPS(10μg/L)刺激3 h后转染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs 6 h;SODN组:LPS(10μg/L)刺激3 h后转染1μmol/L的Scrambled ODNs 6 h;Lipofectamine2000组:LPS(10μg/L)刺激 3 h后加入同等剂量 Lipofectamine2000 6 h。

1.5 细胞核蛋白的提取［3］常规培养SW480细胞，移去细胞培养液，用冷PBS洗细胞2次，转入预冷的2 mL离心管，细胞再用PBS洗1次，3 000 r/min离心3 min，弃去PBS，打散细胞，－80℃冷冻5 min，以200μL缓冲液A重悬细胞，加0.2 mmol/L的PMSF，加Leupeptin至终浓度10μg/mL，吹打细胞，冰上放置2 min。加20μL的1%NP-40，旋涡振荡10 s，5 000 r/min离心30 s，吸上清，沉淀物重悬在50μL预冷缓冲液C中，加10μg/mL的Leupeptin、0.5 mmol/L 的 PMSF，4 ℃振摇15 min，13 000 r/min离心5min，吸上清后移至新的1.5 mL管中，－70℃保存。取少量核蛋白用BCA法测定蛋白质浓度。所有操作在冰浴中进行。

1.6 细胞核 NF-κB p65蛋白检测 采用 Western blot法。将提取的各组细胞核蛋白以50μg/孔上样，12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。后者在含5%脱脂奶粉的TBS中37℃封闭90 min，用TBS冲膜1次，加一抗(兔抗人NF-κB p65单克隆抗体)，4℃孵育过夜，TBS漂洗(10 min×3次);加二抗，37℃作用40 min，TBS漂洗(10 min×3次)。化学荧光法显色。以G3PDH蛋白作内参照。曝光获取图像。将显色条带扫描至计算机，凝胶分析软件对其进行半定量分析。用(目的条带的面积×荧光强度/G3PDH蛋白条带的面积×荧光强度)×100%来表示目的蛋白的相对含量。上述实验重复3次，取均值。

1.7 细胞核NF-κB p65 DNA结合活性检测［4］采用 TransAMTM法。TransAMTMNF-κB p65 kit内含 1个96孔板，每孔固定有 NF-κB共同序列的 ODNs(细胞核内活化的NF-κB可以特异地结合到ODNs。只有当NF-κB活化且结合到它的靶DNA时，用来检测NF-κB的一抗才可以识别p65上的抗原决定簇)。将冻存的细胞核提取物置于冰上，每个样品取5μg，稀释至终体积20μL;取96孔板，每孔加30 μL的Complete Binding Buffer及样品稀释液20μL。薄膜覆盖密封96孔板，室温下100 r/min振荡1 h;倾去液体，每孔用200μL的Washing Buffer漂洗3次，滤纸吸干残存液体;1∶1 000稀释NF-κB p65抗体(一抗)，每孔加一抗稀释液100μL，覆盖密封平板，室温下静置1 h。洗板3次，吸干残存液体;每孔加1∶1 000的HRP标记二抗，密封，室温静置1 h。加入二抗后取出保存的展呈液置于室温下，洗板4次。每孔加100μL的展呈液，室温避光静置5 min，直至培养基颜色变为深蓝色时，每孔加100μL的Stop Solution，蓝色变为黄色，全自动酶标仪上读取450 nm处的吸光度值(A值:表示被测样品NF-κB DNA结合活性)。

1.8 统计学方法 采用SPPS11.0统计软件。两均数比较用t检验，多均数比较用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞核中NF-κB p65蛋白的含量比较细胞核中NF-κB p65的相对含量在对照组为10.1%±3.2%、LPS 组为 91.3% ±17.8%、NODN 组为86.5% ±13.4%、SODN 组为 90.2% ±14.9%、Lipofectamine2000组为 89.7% ±15.1%;LPS 组、NODN组、SODN组、Lipofectamine2000组与对照组相比，P均 ＜0.01;LPS组、NODN 组、SODN 组、Lipofectamine2000组组间相比，P均＞0.05。

2.2 各组细胞核NF-κB p65的DNA结合活性比较细胞核NF-κB p65的DNA结合活性(A值)在对照组为 0.124 ±0.210、LPS 组为 1.547 ±0.110、NODN组为 0.327 ±0.053、SODN 组为 1.509 ±0.172、Lipofectamine2000 组为 1.497 ± 0.167;LPS组、NODN组、SODN组、Lipofectamine2000组与对照组相比，P均＜0.01;NODN组与 LPS、SODN组、Lipofectamine2000组相比，P均＜0.01;SODN组与Lipofectamine2000 组相比，P ＞0.05。

3 讨论

NF-κB 是一种几乎存在于所有细胞中的核转录因子，是以p50和p65两个亚基以不同的形式组合成的同源或异源二聚体。在静息状态下，NF-κB在细胞质内与抑制蛋白IκB结合成无活性的复合物，当细胞受到LPS、炎症因子等刺激时，IκB可磷酸化，使其从 NF-κB 脱落，NF-κB 得以活化，活化的NF-κB转位进入细胞核，调控靶基因的转录，参与机体的免疫反应、炎症反应以及细胞分化和凋亡等多种反应。

由于NF-κB能特异性识别并结合目的基因上的κB序列，利用这个特性，合成包含 κB序列的ds-ODNs并转入靶细胞核，竞争性结合核内激活的NF-κB，抑制其活性［5］，这一策略也被称为 decoy，该策略已经在心血管疾病［6］、肺部疾病［7］、肾脏疾病［8］、炎症性疾病［9］、抗肿瘤［10］的治疗研究中取得了令人满意的结果。

在本研究中，我们用Western blot法检测SW480细胞中NF-κB p65蛋白质的相对含量，结果显示，与SODN组和LPS组相比，NODN组NF-κB蛋白质含量无显著改变，即 NF-κB decoy不影响 NF-κB的细胞核转移。但用TransAMTM法检测NF-κB活性，结果却显示，NODN组NF-κB p65 DNA结合活性显著低于LPS组，即NODN组NF-κB p65 DNA结合活性被抑制。说明 NF-κB decoy ODNs虽不能阻止NF-κB细胞核移位，但可以通过结合占据其功能区域阻断进入细胞核的 NF-κB参与转录调控。而SODN组和Lipofectamine2000组NF-κB p65 DNA结合活性不受抑制。

吴礼国等［9］用NF-κB decoy ODNs 研究发现，NF-κB decoy ODNs的处理并没有减少小鼠结肠上皮细胞NF-κB p65的表达，提示其并没有阻止激活的NF-κB从胞质进入胞核。李磊等［2］在对人脐静脉内皮细胞进行研究时也发现，NF-κB decoy ODNs抑制了NF-κB的结合活性，但抑制不了NF-κB蛋白表达，与本研究结果一致。说明NF-κB decoy ODNs通过抑制核移位后NF-κB的活化，阻止其与靶基因κB位点结合，从而阻止其靶基因的转录，这种作用发生在细胞因子瀑布的上游，能同时阻断多种细胞因子的产生。

本研究结果表明，NF-κB decoy ODNs在体外明显抑制LPS干预后SW480细胞的NF-κB DNA结合活性，因此其有望成为结肠癌、IBD的一种新型的基因治疗药物。

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