微生物脂肪酶概况及其动物营养效应的研究进展

叶 慧 雷建平 左建军 冯定远

(华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642)

脂肪酶（EC3.1.1.3）是广泛存在于各类动物、植物和微生物中的一种酶,在脂质代谢中发挥重要的作用,具有显著的生理意义和生产应用的潜能（Jaeger等，1994；Gupta等，2004）。微生物来源的脂肪酶含量最为丰富，包括细菌、霉菌和酵母来源的。由于微生物种类多、繁殖快，易发生遗传变异，产生的脂肪酶具有比动植物脂肪酶作用更广的pH值、反应温度范围以及底物专一性；而且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和样品提纯，因此，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，是生物技术和有机化学应用中使用最为广泛的酶类之一。虽然许多研究者在通过微生物筛选获取优质的脂肪酶方面已取得令人满意的结果，但有学者认为，在不久的将来，使用基因工程菌生产脂肪酶将占主导地位，因为工程菌将实现为特定应用领域生产适合的具有显著特性的脂肪酶（Treichel等，2010）。

相对于植物和动物源脂肪酶而言，微生物脂肪酶更适合作为饲料添加剂作用于动物肠道，促进动物肠道内脂质消化和吸收。以动物肠道作为酶反应场所，其环境既具有稳定性又有不可控性，特定动物的消化道其特定部位的pH值、温度基本是稳定的，但动物生理状态和日粮品种等许多因素不可控，为此，需要选择合适的脂肪酶应用于动物日粮。

1 微生物脂肪酶概况

1.1 产脂肪酶的微生物来源

地球大约2%的微生物可以产生脂肪酶（Hasan等，2006）。Sharma等（2001）统计产脂肪酶的微生物共33个属，其中革兰氏阳性菌来源的7个属，30种菌；革兰氏阴性菌来源的4个属，17种菌；霉菌来源的14个属，42种菌；酵母来源的7个属，20种菌；放线菌类来源的1个属，5种菌。由于微生物的多样性，我们相信产脂肪酶的微生物远远大于这个数目。

虽然脂肪酶的菌源很多，但可应用于商业生产的野生菌或其重组型却是少数，其中重要的种类有：无色杆菌、产碱杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、伯克氏菌、色素杆菌和假单胞菌（Jaeger等，1994；Palekar等，2000）。目前大多数商品脂肪酶产酶菌都属于根霉属、曲霉属、青霉属、地霉属、毛霉属和根毛霉属(Treichel等，2010)。

1.2 微生物脂肪酶特性

微生物脂肪酶是作用在油-水界面的丝氨酸水解酶。其催化三联体是由Ser-Asp/Glu-His组成，通常在丝氨酸活性部位周围拥有共同序列(Gly-x-Ser-x-Gly)。脂肪酶的三维立体结果显示了α或β水解酶折叠的性质(Nadine等，1999)。脂肪酶在水相和非水相的界面催化酯键水解，这是脂肪酶和酯酶的不同之处（Panzanaro等，2010）。除此之外，脂肪酶还有多种酶活性，如催化多种酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换(Jaeger等,1999)。微生物脂肪酶的各种特性主要包括分子量、最适pH值、最适温度、稳定性和底物特异性等方面，这些酶学特性已有大量文献进行阐述(Dharmsthiti等,1998;Pratuangdejkul等，2000；Snellman等,2002；Mahadik 等,2004;Mhetras等,2009)。

Gupta等（2004）把微生物脂肪酶分为3大类：即非特异性、特异选择性和底物特异性基础上的脂肪酶。非特异性脂肪酶随机作用于甘油三酯分子，甘油三酯被完全水解为脂肪酸和甘油。与此相反，特异性脂肪酶是1，3位特异性脂肪酶，只水解甘油三酯C1和C3酯键，从而产生游离脂肪酸、1，2-甘油二酯、2，3-甘油二酯和2-甘油单酯。细菌胞外脂肪酶是特异性脂肪酶。第三类脂肪酶包含脂肪酸特异性脂肪酶，它表现为明显的脂肪酸优先水解性。

2 外源脂肪酶在动物消化道的营养效应及作用机理

酶制剂的营养效应，是由于酶制剂直接作用于水解底物，从而产生一系列生理生化的变化，直接或间接地对动物产生的营养作用。关于酶制剂在动物体内发挥的营养效应，是与许多不同的底物协同起来产生作用的，酶制剂在肠道内的间接作用有时比其直接作用更为重要。酶制剂跟不同底物搭配具有不同的营养效应。

早在20世纪八、九十年代，国外就已经有学者研究脂肪酶在饲料中的应用，但由于动物胰脂肪酶的提纯技术还不够完善，导致脂肪酶中可能掺杂一些杂质，如CCK等，导致出现畜禽日粮中添加脂肪酶降低了采食量和生产性能的现象，严重影响了脂肪酶在饲料中的应用（Al-Marzooqi等，1999、2000）。Polin 等（1980）给白来航公鸡饲以含4%动物油的玉米基础日粮，研究了猪胰脂肪酶粗提物与胆汁盐对脂肪消化的影响，在添加和不添加0.4%胆汁酸的情况下，孵化后第2～9 d添加0.1%的脂肪酶均能提高脂肪的吸收，但效果不显著。主要原因是在酸性条件下，猪胰脂肪酶容易失活，当其到达主要作用位点(十二指肠)时其活力已经相当低了，并且猪胰脂肪酶活性的发挥依赖于辅脂酶及胆汁盐的存在。如果脂肪酶能够耐酸，且其活力不依赖于辅脂酶及胆汁盐，那么从理论上说将其添加到日粮中应该能够提高脂肪的消化。

2.1 弥补内源脂肪酶不足，促进脂肪消化吸收

微生物脂肪酶相比于肠道脂肪酶具有更强的耐受性。Canioni等(1977)通过体外试验发现，根霉菌来源的脂肪酶不需要辅脂酶的协助即可发挥作用。Kermanshahi等(1998)研究表明，在家禽小肠近端环境下，辅脂酶对微生物脂肪酶没有促进作用。Raimondo等(1994)研究发现，相比于猪胰脂肪酶，荚壳假单胞菌来源的脂肪酶不受辅脂酶和胆汁酸的影响，他们认为细菌源的脂肪酶的耐受性比猪胰脂肪酶更强。Namboodiri等（2000）研究发现，黑曲霉源脂肪酶在天然条件下能够不被胰蛋白酶和糜蛋白酶水解（说明微生物脂肪酶耐蛋白酶，可以在肠道发挥作用）。因此，外源添加微生物脂肪酶能够到达小肠发挥促进脂质消化的作用，有效地补充内源脂肪酶的不足。

Pratuangde等（2000）从不动杆菌LP009中分离的脂肪酶，在50℃、pH值7.0时活性最高，在45℃以下，pH值4.0～8.0之间，均有稳定的活性，该酶能改善大豆粉和预混合动物饲料中脂肪的消化。秦鹏（2003）试验表明，乳化剂与脂肪酶复合使用显著提高了35～49日龄及 21～49日龄肉鸡的平均日增重（P＜0.05），改善了饲喂动物性脂肪的肉鸡生产性能和经济效益，但是乳化剂与脂肪酶没有显著互作。何前等（2009、2010）试验表明，日粮中添加脂肪酶可以显著提高黄羽肉鸡和岭南黄公鸡的生产性能，提高其脂肪表观消化率，并不同程度地影响了其他营养成分的表观消化率。

2.2 调节CCK分泌，影响胰腺消化酶分泌和采食

CCK作为一种主要的胃肠激素，调节胰腺分泌、胆囊收缩和抑制胃部运动等，这些功能都与脂肪的消化吸收有着重要关系。CCK水平除了受到中枢神经的调节，也受到日粮成分的调节（Rodger，2000）。脂肪和蛋白的水解产物能最有效地刺激CCK的分泌，其中甘油三酯水解产物中的脂肪酸，蛋白水解产物中的二肽、三肽或氨基酸能有效地刺激CCK分泌(Brodish等，1994；Rodger，2000)。Tanaka 等（2008）给小鼠胃部和十二指肠灌注辛酸和α-亚麻酸，结果发现，通过胃部灌注α-亚麻酸极显著升高血清中CCK含量，此外试验验证了长链脂肪酸诱导CCK分泌是通过GPR120和钙离子信号作用的。Matzinger等（2000）试验表明，长链脂肪酸可以刺激CCK分泌，从而抑制了采食。所以胃肠道对脂肪酶水解脂肪产生的游离脂肪酸的回应是双方面的，一方面促进消化酶分泌，促进消化；另一方面又抑制采食。当日粮中额外添加外源脂肪酶，脂肪在到达胃肠之前就有可能被外源脂肪酸部分水解，产生游离脂肪酸，作用于胃部的脂肪酸受体，从而刺激CCK和胰消化酶的分泌，同时也会不同程度上抑制采食。

2.3 与油脂协同作用，抑制肠道内有害病菌繁殖

在畜禽生产中，由于抗生素的逐步禁用，抗生素类药物代替品一直是研究的重要内容。Dierick等(2002、2003、2004)利用含有中链脂肪酸的油脂和脂肪酶的协同作用，在模拟胃环境(37℃、pH值3～6、3 h)下的组合水解试验表明，适量添加脂肪酶能部分释放中链脂肪酸。试验表明，这些中链脂肪酸能够调节和稳定胃肠道微生物群系，对有害微生物的生长具有显著的抑制作用，起到类似抗生素的作用。由此推测，脂肪和脂肪酶的合理搭配可能起到降低仔猪饲料中抗生素使用量的作用。

2.4 改变脂肪水解产物，影响体内脂质代谢

虽然微生物脂肪酶在畜牧生产中应用具有良好的前景，但是试验研究发现，微生物脂肪酶添加到动物饲料中，仍存在一些有待解决的问题，如非特异性脂肪酶水解产物多样性，其产物的营养效果尚不明确。Lichovnikova等（2002）试验表明，日粮中长期添加脂肪酶增加蛋鸡平均蛋重和脂肪沉积，显著提高肝脏重量（P＜0.05）和极显著提高鸡蛋多不饱和脂肪酸含量（P＜0.01）。而另外一方面，Meng等（2004）研究发现，1，3-甘油二脂可以显著降低大鼠的肥胖程度和抑制其体内脂肪的蓄积,起到减肥的效果,并且这种效果呈现一定的剂量相关性，而其抑制机理尚不清楚。其试验所用的1,3-甘油二脂就是通过脂肪酶转脂作用得来的,这有可能会给畜禽生产带来潜在的负面效果。而且如果选用非水解特异性脂肪酶，也可能在水解过程中产生1-甘油单酯、3-甘油单酯或甘油，其在肠道内吸收机制和利用效果与2-甘油单酯不同，且吸收速度比 2-甘油单酯慢（Meng等,2004；Iqbal等,2009）。

2.5 影响饲料质量

微生物脂肪酶作用位置和作用程度难以控制，容易影响饲料质量。添加脂肪酶可能加快饲料中原有脂肪的分解，影响饲料的贮藏稳定性。Dierick等(2002)对3种不同油脂的饲料配方分别进行添加或不添加脂肪酶的贮藏试验中发现，在20℃下贮存6个月后，其脂肪分解为每千克总脂肪酸含有250～850 g游离脂肪酸，其中添加了脂肪酶的配合饲料油脂分解明显高于不添加脂肪酶的配合饲料。Hassan(1998)试验也认为，在肉鸡和火鸡日粮中添加脂肪酶却不能发挥促消化和生长的作用，主要可能是每克饲料中添加400 U水平的饲料相对对照组在混合或者贮存过程中，甘油三酯几乎完全水解成游离脂肪酸和甘油，即游离脂肪酸的存在有可能降低了脂肪的利用率，或者对内源胰消化液的分泌有负反馈作用。

而且不同脂肪酶的活性不同，其导致的油脂分解程度也不同。其他相关试验结果表明，脂肪的水解比例还受乳化剂、热处理时间和贮藏温度等因素的影响。脂肪水解可能降低其抗氧化能力，不利于饲料长期存放。

3 展望

目前市面上饲料用脂肪酶并不多，但是用于工业的脂肪酶生产已经比较成熟，具有推广应用于饲料添加剂的前景，但是两个领域对脂肪酶的要求并不同，如何筛选适合的脂肪酶作为饲料添加剂尤为重要。组合型酶制剂在完全可控的条件下具有协同增效的作用，但是在动物饲养环境中，由于因素太多，其增效作用并不如可控条件下明显，因此，如何优化组合酶制剂也是一个研究的重点。此外，由于脂肪酶的水解特异性，其水解产物对于动物而言并不完全是最适的，为了得到最优的生产效果，所以还得通过筛选、优化组合、饲养试验，挑选出对动物生产最适的脂肪酶。

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