抗菌肽的分子设计研究进展

苏庆红，许晓群，王郡甫

（山东省医学科学院基础医学研究所 山东省现代医用药物与技术重点实验室，山东 济南 250062）

抗菌肽的分子设计研究进展

苏庆红，许晓群，王郡甫

（山东省医学科学院基础医学研究所 山东省现代医用药物与技术重点实验室，山东 济南 250062）

抗菌肽因其具有广谱高效的抗菌特性，且不易引起耐药性，成为最有潜力的肽类抗生素。为使抗菌肽更加高效、低毒，需对天然抗菌肽进行分子设计改造。就影响抗菌肽抗菌活性的相关因素和分子设计方法等方面的研究进展进行了综述。

抗菌肽；抗菌活性；分子设计

抗菌肽（Antimicrobial peptides）是生物体在外界病原微生物入侵时产生的具有抗菌活性的多肽物质，通常由12～45个氨基酸组成，分子量约40 k D，是生物体非特异性免疫的重要组成部分。抗菌肽一级结构具有典型特征，即N端富含Lys和Arg等极性氨基酸，而C端富含Ala、Val和Gly等非极性氨基酸，中间部分富含Pro，因此抗菌肽主要以阳离子形式存在。到目前为止，抗菌肽数据库所收集的抗菌肽种类已经超过1900种，主要来源于原核生物和真核多细胞生物［1］。

1 对抗菌肽进行分子设计的目的

抗菌肽除了具有快速、广谱、高效的杀菌特性外，还不会引起致病菌抗药性的增强，而且能杀灭部分耐药性致病菌。因此，抗菌肽自发现以来就被认为是传统抗生素的最佳替代品。然而，天然抗菌肽并非完美无缺，大部分天然抗菌肽的抗菌活性不高，部分抗菌肽在与细胞膜相互作用的过程中对真核细胞产生的细胞毒性也限制了抗菌肽在临床上的应用［2］。因此，提高其抗菌活性、降低毒性是抗菌肽分子设计改造的主要目的。

抗菌肽分子设计是基于抗菌肽的结构与功能的关系，通过一系列生物信息学方法，实现对天然抗菌肽的定向改造或全新设计，以获得更加符合人们需要的抗菌肽类抗生素。

抗菌肽根据其结构特点主要分为3类：线性α－两亲螺旋肽、富含Pro的线性肽、β－折叠抗菌肽［3］。其中，线性α－两亲螺旋肽结构简单，分布广，数量多，而且抗菌谱广，对G＋菌、G－菌、真菌和原生动物具有不同的抗菌活性［4］。α－螺旋结构在抗菌肽发挥抗菌作用的过程中十分重要：它们聚集起来在细胞膜上形成穿孔或通道，诱导大量的细胞膜裂解，导致细胞失活［5］。因此，抗菌肽的结构与功能研究以及分子设计大部分集中于线性α－两亲螺旋抗菌肽。

2 影响抗菌肽抗菌活性的因素

抗菌肽的抗菌活性主要由其分子结构所决定。研究表明：抗菌肽的α－螺旋结构、两亲性结构、正电荷数、特殊结构（特殊残基、铰链结构）以及细菌细胞膜的组织结构等都是影响其抗菌活性的重要因素。

2.1α－螺旋结构

α－螺旋结构是一类极好的水脂两亲结构，存在于许多膜蛋白、信号肽和其它具有膜识别功能的蛋白中，是组成蛋白质最丰富的二级结构［6］，也是抗菌肽破坏、裂解细胞的主要结构。典型的α－螺旋结构近似于圆柱形，圆柱形纵轴的一面为带正电荷的极性面即亲水区，另一面为非极性面即疏水区。由抗菌肽数据库可知，具有α－螺旋结构的抗菌肽已超过290种［1］。

为了提高抗菌肽的抗菌活性并降低其溶血性，马清泉等［7］采用螺旋轮投影法设计了16个氨基酸长度的肽VGR16，其中8个Val分布于螺旋轮的非极性面，5个Arg分布在极性面。抗菌实验显示VGR16具有快速杀菌的作用，而且该肽在较高浓度时未见溶血活性，对哺乳动物几乎没有细胞毒性。

实验证明抗菌肽序列中α－螺旋结构对其抗菌活性具有重要的作用。但是单纯添加α－螺旋结构并不一定能提高抗菌活性，可能与氨基酸的疏水性和形成α－螺旋结构的构象有一定的关系［8］。对天蚕素A的2个α－螺旋区分别进行表达和联合表达显示，抗菌肽的抗菌活性不仅与α－螺旋的数量有关，还和其它因素如正电荷数和疏水性等有关［9］。

另外，研究者还对线性α－螺旋肽的环化作用进行了研究。Oren等［10］对线性两亲α－螺旋肽及其非对映异构体以及两者的环化物进行了结构与功能的研究。他们选择疏水性和所带正电荷数都相同的氨基酸序列，用对α－螺旋形成具有不同倾向的类似物来检验线性化和环化对α－螺旋的形成、生物学功能、膜的连接和渗透的作用。结果表明：环化物对G＋菌和G－菌都有生物学抗菌活性，比线性肽的抗菌谱更广，而且环化作用提高了抗菌肽在细菌和人类红细胞之间的选择性，环型抗菌肽的溶血性更低。

2.2 两亲性结构

两亲性是抗菌肽具备抗菌活性的重要结构特征。两亲性结构有利于抗菌肽与细胞膜的结合，亲水性和疏水性氨基酸分别排布在α－螺旋结构的两侧，形成明显的亲水面和疏水面；或者分别集中在α－螺旋的N端或C端，形成明显的亲水端和疏水端。由于α－螺旋具有两亲性，所以抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，使细菌因不能保持正常的渗透压而死亡［11］。

实验证实增强两亲α－螺旋非极性面的疏水性能提高抗菌活性。Chen等［12］以含26个氨基酸残基的两亲性α－螺旋抗菌肽V13KL作为结构框架，研究了抗菌肽的疏水性对其抗菌活性的影响。在V13KLα－螺旋的非极性面上以疏水性更强的Leu代替Ala以增强疏水性或者将Leu换成Ala以减弱疏水性。抗菌实验结果表明，疏水性对抗菌肽的抗菌活性有两种影响：在疏水性水平相对较低的阶段，增强肽的疏水性达到最优疏水性时能使抗菌活性得以改善；然而，超出最优疏水性后会导致抗菌活性的明显丧失。这可能是因为，过强的疏水性会使多肽自我凝聚的能力增强，使溶液中能够有效发挥作用的抗菌肽分子减少。

疏水性片段的链长对抗菌活性也有影响：如对于蜂毒肽C末端片段的反序肽，为保持其较高的抗菌活性，疏水性片段的残基数最少为8个［13］。

研究发现，肽的疏水性影响着孔道形成率、孔径大小和孔道稳定性，同时还影响到肽脂的作用模式。疏水性的强弱和疏水性氨基酸在肽链中的位置有关［14］。通过对一系列α－螺旋抗菌肽进行结构分析显示：抗菌肽是否具有溶血活性取决于N端结构域的组织方式，通过设计特定位点的突变可消除抗菌肽的溶血活性［15］。

2.3 正电荷数

抗菌肽的正电荷被认为是其结合细菌细胞壁和细胞外膜的基础。带正电荷的抗菌肽通过静电作用结合到带负电的细菌磷脂膜上，然后在细菌细胞膜上形成离子通道或者裂解细胞膜，进而杀死细菌。

极性面的净正电荷对抗菌肽的抗菌和溶血活性很重要。杂合肽CP－P是由天蚕素、蜂毒肽和蛙皮素的序列片段杂合而成，将CP－P第16位的Leu换成Ser得到含7个净正电荷的S16，再将S16极性面第11位的Ser换成Lys得到含8个净正电荷的K11，K11的活性明显提高，其最小抑菌浓度（MIC）降至S16的一半，而治疗指数上升为S16的两倍［16］。

还有研究者探究净正电荷和带正电荷残基对LV13K极性面的生物活性的影响发现，在L－V13K的极性面增加一个正电荷后其溶血活性会发生突然性的变化。当正电荷从8增加到9时，溶血活性提高了32倍。表明一旦α－螺旋上的净正电荷数超出最优范围之后，抗菌肽的溶血活性对净正电荷的增减非常敏感［17］。

进行分子设计时，为使抗菌肽具有一定的抗菌潜力和广度，净正电荷数一般控制在3～9较为合适［4］。但实验也证明单纯增加正电荷并不一定能提高抗菌肽的抗菌活性［8］。

2.4 特殊结构

2.4.1 残基替换

残基替换是结构与功能研究常用且有效的方法，对于克服天然抗菌肽的毒性效果较理想。常用的残基替换包括以D－氨基酸替换L－氨基酸、以极性氨基酸替换非极性氨基酸和特殊残基等。

氨基酸的构型对某些抗菌肽的活性有重要影响。傅立叶变换衰减全反射红外光谱研究表明，沿着抗菌肽的主链并入33%的D－氨基酸，能够促进肽链产生占主导地位的螺旋结构。研究还发现那些结合了D－氨基酸的抗菌肽被环化以后抗菌活性会提高，有助于开发新型抗菌肽［10］。以极性氨基酸残基Ser替代位于杂合肽CP－P非极性面的非极性氨基酸残基Leu后，治疗指数上升，说明极性氨基酸对非极性氨基酸的替换能够影响两亲性进而在一定程度上影响抗菌活性，这对于未来抗菌肽的研发意义重大［16］。以Trp替代含21个氨基酸残基的多肽（KAAKKAA）3不同位置上的Ala，若将Trp定位在阳离子区的对面则该肽不表现抗肿瘤活性；若将2～3个Trp定位于阳性面的邻近位置，则该肽表现出对真核细胞高度的溶血活性［18］。

2.4.2 铰链结构

铰链结构对某些抗菌肽的活性是必不可少的，它的存在有助于抗菌肽的疏水端插入细胞膜的脂质双分子层。杂合肽CA（1－8）－MA（1－12）（CA－MA）具有铰链区Gly－Ile－Gly，铰链区被删除后的类似物对细菌和肿瘤细胞的裂解活性明显降低，说明铰链区对CAMA的抗菌活性至关重要［19］。

2.5 细菌细胞膜的组织结构

细菌细胞膜的结构和组分也是抗菌肽分子设计需要考虑的因素之一。采用固态氢谱法研究两亲性α－螺旋模型肽MSI－103的活性与膜结构的排列方式之间的关系，结果显示：对于具备饱和链的液体结晶磷脂酰胆碱细胞膜来说，随着多肽浓度的增大，两亲性α－螺旋在膜表面的定位由与膜紧密结合的S型变为倾斜的易于侵入的T型；而对于不饱和链的磷脂酰胆碱细胞膜来说，在任意浓度时两亲性α－螺旋均呈现S型状态。与S型相比，T型更有助于多肽透过细胞膜［20］。

3 抗菌肽分子设计的方法

3.1 应用序列模板设计抗菌肽

大部分抗菌肽N端具有α－螺旋结构域，并且第1位上Gly存在的比例大于70%，第8位上Lys存在的比例大于50%。Tossi等［4］广泛收集抗菌肽自建数据库，并且参考电荷、极性和疏水性残基的特点给出了一个典型的两亲性α－螺旋肽的序列模板：ghhp＋hxpxh＋phh＋xhhxh。该模板在一定程度上总结了多样性的抗菌肽序列，为抗菌肽的分子设计提供了参考。

3.2 基于地毯机制设计抗菌肽

基于地毯机制设计的抗菌肽的非对映异构体既包含D－氨基酸又包含L－氨基酸，是新型的非溶血性抗菌肽。由于新设计的非对映异构体在抗菌活性方面显示出优于天然L－氨基酸多肽的特征，因此它们有望发展成为临床上进行体内外治疗的药物［21］。

3.3 截取天然抗菌肽的部分序列

天然抗菌肽的所有氨基酸序列并非都是必须存在的，而且肽链的位置不同功能也不相同。有目的地选取肽链的特殊部位并且删除无关紧要的序列，从而获取有效的短小肽链是抗菌肽分子设计的常用方法。研究者截取天蚕素CA19的部分肽链并在大肠杆菌中高效表达，抗菌实验显示该肽链具有较强的抑菌活性［22］。还有研究者截取抗菌肽Lactoferrin的不同部位，发现仅保留N端的10个氨基酸残基就能保留其抗菌活性［23］。

3.4 杂合肽的设计

将不同肽链的优点联合起来可望开发出功能更加完善和高效的新型抗菌肽。例如Cecropin A抗细菌的能力强，而Magainin 2抗真菌的能力强，选取两者N端部分氨基酸残基制成杂合肽Cecropin A（1－8）－Magainin 2（1－12）后，抗菌活性更强且没有溶血活性［24］。

3.5 其它设计方法

除以上4种方法以外，还有一些设计抗菌肽的新型方法，例如设计反序肽［13］、设计多拷贝的串联重复序列［18］等。

4 展望

现代医药面临着病原菌耐药性提高的难题，急需开发各类抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的新型药物。目前，抗菌肽在医药上主要应用于局部治疗，由于其合成药剂发挥作用的使用量在体内接近毒性剂量，因此，其系统使用还处于临床前的研究阶段［25］。抗菌肽作为治疗细菌感染等的药物来源已经得到认可，为得到更加高效、低毒的抗菌肽，其分子设计研究也处在快速发展阶段。分子设计研究为揭示抗菌肽的结构与功能关系提供了突破口，为开发安全高效的临床药物提供了可行的途径。然而，现有研究结果也显示：影响抗菌肽抗菌活性的许多参数是紧密相关的，改变其中一个参数可能会引起其它参数的重大变化［26］。因此，开发理想的抗菌肽还需要继续进行深入研究。

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Research Progress of Molecular Design of Antimicrobial Peptides

SU Qing－hong，XU Xiao－qun，WANG Jun－fu
（Key Laboratory for Modern Medicine and Technology of Shandong Province，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Sciences，Ji′nan250062，China）

Antimicrobial peptides have shown broad spectrum and efficient antimicrobial activity，and are not easy to induce antibiotic resistance.To obtain higher efficiency and lower toxicity，natural antimicrobial peptides need to be designed and transformed.In this paper，the molecular design of antimicrobial peptides are reviewed，focusing on the related factors affecting their antimicrobial activity and the molecular design methods.

antimicrobial peptide；antimicrobial activity；molecular design

Q 812

A

1672－5425（2012）11－0001－04

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.001

山东省自然科学基金资助项目（ZR2010CM067，ZR2009CM036）

2012－08－14

苏庆红（1976－），女，山东莱芜人，硕士，助理研究员，主要从事抗菌药物的研究，E－mail：qinghong2007ok＠163.com；通讯作者：许晓群，副研究员。