疾病标志物——血清microRNA的研究进展

戴启宇，杨廷桐，于芳芳

寻找疾病标志物一直是医学界探索研究的重要领域。标志物在早期诊断、个体化治疗、预后判断等诸多方面都具有重要价值。新近研究发现：血液中micro RNA（miRNA）能够游离于细胞之外，稳定存在于循环血液中，其在组织或血清中的异常表达与多种人类疾病密切相关[1]，并在多种疾病诊断和预后判断中显示了独特价值。血清miRNA检测，不仅创伤小、方法简便、结果准确可靠，且还可以改进疾病诊断、癌症分类、预后评估、疗效及复发预测的精度。可见miRNA已具备了疾病标志物的特点。目前，检测血液中miRNA表达谱的技术已经成熟，精确度和灵敏度可满足临床需求，因此，miRNA有望成为血液中新兴的疾病诊断和预后判断的分子标志物。

1 miRNA的生物学特征及功能

1.1 生物学特征 miRNA是一组由动物、植物和病毒基因组所编码的一类分子非编码单链RNA，长约19～25个核苷酸，它们不具有开放阅读框（ORF），不编码蛋白质，但却参与机体的各种重要的生理和病理过程，它们能够与靶mRNA的3＇-UTR（untranslated region）区的碱基互补配对而起作用，使其翻译受到抑制，从而在转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用[2]，对机体生长、发育及各种疾病尤其是肿瘤的发生和发展具有重要的调节功能[3]。几乎成为基因表达强有效的调控因子，据推测人类约有1/3基因编码的mRNA受到miRNA的负调控[4]。研究表明，每个miRNA可能调节数百个靶基因，参与生命活动中众多的信号转导途径，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及血管生成等一系列过程中发挥作用[5，6]。具有严格的时空性和组织的特异性。

1.2 生物学功能 众所周知，血浆或血清中存在大量的外切酶，已有实验显示裸露的mRNA或miRNA在加入血浆或血清中后会很快降解[7]。因此，miRNA肯定不是以裸露的形式存在于血浆、血清中，一定存在某种保护机制来抵抗RNA酶的作用。血浆、血清miRNA的功能研究的前提是应该阐明其存在形式、释放机制、受体细胞是如何接受的等问题。已有证据显示细胞在生理或病理状态下，能释放或脱落某些具有膜结构的微泡，直径从数十纳米至数微米不等，按照大小或来 源 不 同 取 名 为 exosome、microparticle、microvesicle、apoptoticbody等，这些微泡中就含有miRNA，其膜结构可以抵抗RNA酶对miRNA的酶切作用，推测这是miRNA能稳定存在于血浆、血清中的主要原因。尽管已有利用微泡中的miRNA作为疾病标志物在非小细胞肺癌 、卵巢癌以及口腔肿瘤中的研究报道[8]，但微泡之中成分复杂，除了miRNA之外，还富含蛋白质、DNA和RNA，因此没有很好的对照，很难将某种由微泡导致的生物学效应完全归因于其中的某种miRNA。Zerecke等[9]利用miR-126特异性敲除小鼠，研究了微泡中miR-126的功能。他们发现内皮细胞释放的微泡中miR-126的含量最高，并且显著高于来源内皮细胞的含量；这些微泡在被内皮细胞接受的同时，将miR-126传递给受体细胞，miR-126在受体细胞内含量的增加，通过抑制CXCL12上游的负调控因子RGS16，致CXCL12表达量上调：利用ApoE（-/-）小鼠在高脂餐诱发的动脉粥样硬化动物模型中研究发现，CXCL12表达量增高后，可以促进lin-Sca-1+内皮祖细胞在粥样斑块形成之初就聚集在斑块周围，进行损伤修复，从而减少斑块面积，防止斑块形成，维持斑块稳定。这项研究，首次正面回答了血浆、血清miRNA是否具有生物学活性的问题，并且提供了血浆、血清miRNA研究可供借鉴的思路。

2 miRNA检测的方法学研究

目前国内外采用血中miRNA检测方法主要有：miRNA芯片、高通量测序法（Illina／Solexa）、Northern blot法和荧光实时定量逆转录PCR（QRT-PCR）法等[10]。提取需要的血液样本量，从100 μl到2 ml不等，Chen等[11]的研究就采用Solexa测序方法，并且可以发现和鉴定新的miRNA分子，但是价格偏高。相比之下miRNA芯片（microarray）要比测序方法价格便宜许多，缺点是重现性和准确性比较差，只用于疾病相关循环miRNA的初筛，这种方法只能对已知的miRNA进行检测，无法寻找和发现新的miRNA分子。Northern blot方法繁琐且灵敏度低，不宜用于高容量检测。那么miRNA血中表达与量检测的最好方法是QRT-PCR法，此法操作简便、快速、高效、敏感性高和特异性强。Chen等使用10 μl血清进行不提取RNA，直接QRT-PCR分析的结果，与血清提取RNA后进行QRT-PCR分析的结果一致。如能优化这种方法将显著减少血清用量、步骤及成本。采用Taqman探针或者SYBR荧光染料检测的QRT-PCR法主要是基于茎-环的RT-PCR方法（stem-loop RT-PCR）和基于poly（A）加尾的TR-PCR方法。前者特异性更高，后者通用性好。

3 miRNA在临床医学中的研究

从2008年血浆、血清中存在miRNA最早被报道后，对它的研究一直方兴未艾，至今所涉及的疾病领域主要为肿瘤和非肿瘤两大类。

3.1 肿瘤类疾病 miRNA在不同条件下可行使癌基因或抑癌基因的功能，有些miRNA表达具有组织特异性，如miR-122仅在肝脏中表达，有些miRNA在肿瘤中表达上调，如：miR-21在成胶质细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等[12]。有些miRNA在肿瘤中表达下调，如：miR-15a和miR-16在垂体腺瘤和慢性B型淋巴细胞性白血病等[13]。let7家族在肺癌中下调，预示肺癌的发生及术后生存期短，此外，MYC蛋白的过表达也可以直接抑制let7家族的活性[14]。miR-122的调控功能涉及肝脏细胞生长、代谢、蛋白表达和病毒感染等多种过程，miR-122下调表达和肝癌发病密切相关。miR-25、miR-34家族调节p53的表达，在多种肿瘤中起重要的调控作用[15，16]，而且miR-34b/miR-34c在胃癌和神经母细胞瘤等肿瘤中均表达下调。此外，miR-145的表达下调与乳腺癌和结肠癌发病风险相关。在肿瘤组织下调表达的miRNA靶基因大部分增强了细胞的生长、发育或增值活性，当miRNA表达下调时，这些基因过量表达导致细胞生长失去控制，发生癌变。

血清中是否存在miRNA相对应的表达谱，一直是研究者所关注的问题，2008年至今已有多项血清miRNA与肿瘤关系的研究报道，这就为血清miRNA作为分子标记应用于临床肿瘤的早期诊断和预后提供了工作基础。血中的miRNA主要来自组织细胞的主动分泌过程[17]，成熟的miRNA在细胞内被脂质或脂蛋白包被成外切酶体（Exosome），分泌至胞外并进入血液去掉包被，释放出miRNA发挥其生物学功能[18]。外切酶体介导的细胞间miRNA交换，是细胞通讯的一种新的途径，对维持内环境的稳态有重要作用[19]。

3.1.1 消化道肿瘤 2010-02血浆中的miR-92被成功用作诊断结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89%，特异性达到70%，术后显著降低；更加令人兴奋的是，通过miR-92作为分子标志物可以诊断Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌，而早期诊断可以大大提高生存率和改变预后[20]。Huang等[21]研究发现miR-29a和-92a在CRC患者血浆中明显增高。Wang等[22]研究了胰腺导管腺癌（pancteaticductal adeenocarcinoma，PDA）患者血浆中miRNA的水平，发现miR-155的水平在肿瘤形成的早期就明显增高，而miR-196a的水平高低和患者病程相关，其灵敏度和特异度分别是64%和89%。Tsujiura等[23]对胃癌患者血浆中miR-21、-106a、-106b、-17-5p和let-7a的水平与健康人进行了比较，发现在胃癌患者血浆中let-7a明显降低，而其余4个miRNA均显著增高。

3.1.2 肺癌 Chen等[24]挑选了利用测序技术发现的在肺癌患者中具备有效拷贝数的miR-25和-223两种miRNA显著上调。Hu等[25]为研究血清miRNA在肺癌患者预后判断中的作用，挑选了60例Ⅰ～Ⅲa期的肺癌患者，这些患者均接受手术和化疗，按照生存期的长短分为较长和较短生存期2个亚组各30例，所有患者的血清均采用高通量测序技术，发现至少11个miRNA的变化在5倍以上，在随后243例肺癌患者血浆标本的验证过程中，发现其中miRNA-486、-30d、-1和-499可以作为总生存率独立的预测因子，亦可作为肺癌检测的标志物。miRNA几乎参与了肺癌病变进程的每一个环节，对基因的调控改变了肿瘤表达状态[26，27]。

3.1.3 血液系统肿瘤 ①弥漫性大B细胞淋巴瘤：关于血清中miRNA是否可运用于肿瘤诊断研究，最早的报道来自Lawrie等[28]在大 B细胞淋巴瘤 （diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）的研究，他们挑选了和肿瘤相关miR-155、-210、-21，比较了在DLBCL患者和健康人群之间血清水平的差异，发现DLBCL患者血清中三者的含量均显著高于健康人，且血清miR-21的不同水平决定了患者不同的生存曲线；与此前miR-21与预后良好正相关的报道吻合；②急性白血病：Tanaka等[29]利用miRNA芯片比较了急性白血病（acute leukemia，AL）患者和健康人之间的血浆miRNA表达谱，发现运用miR-92a和-638的比值能显著的区分AL患者和健康人；进一步运用原位杂交技术发现，无论是急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞性白血病患者，其肿瘤细胞中miR-92a的含量均明显增高，而在健康人中含量微弱。

3.1.4 乳腺癌 在对乳腺癌的研究中发现：血清miR-155水平在乳腺癌和非乳腺癌患者中没有显著性差异，但miR-155在孕酮受体阳性的乳腺癌患者血清的表达水平高于孕酮受体阴性的患者[30]，提示miR-155可以作为区分激素敏感性和非敏感性的乳腺癌患者的分子标志物，进一步证明血清miRNA具有成为肿瘤诊断和预后标志物的潜力。Heneghan等[31]挑选了和乳腺癌相关的7个miRNA在乳腺癌患者的肿瘤组织和血浆中进行了比对，发现miR-195是乳腺癌组织特异的miRNA，在血浆中的水平均要高于正常，能很好地反映患者肿瘤生长的临床病理特征，并与淋巴转移以及孕酮受体的状态等均密切相关。miR-21的改变与肿瘤耐药有密切关系[32]。

3.1.5 口腔肿瘤 在对舌鳞状上皮细胞癌的研究中发现，miR-184在癌组织中的表达提高了59倍以上，患者术后的血浆miR-184表达量降低到只有原来的1/10，这表明血清中miRNA表达谱的变化与肿瘤组织关系密切，血清miRNA表达谱有可能替代组织miRNA表达谱作为口腔肿瘤标志物[33]。正常人血清含量很低或无法检测到，而在肿瘤患者血清中含量较高的miRNA可以确认为肿瘤的分子标志物。上述研究结果显示，血清miRNA与肿瘤组织中miRNA的表达谱相关，在以后进一步的研究中将加速血清miRNA作为肿瘤标志物应用于临床检测的进程。

3.2 非肿瘤类疾病 非肿瘤类疾病主要包括妊娠、组织损伤、败血症、心衰等研究领域。

3.2.1 妊娠 在对孕妇血研究中进一步分析发现miR-141在早、中、晚期妊娠阶段的含量各不相同，在妊娠晚期含量最高[34]。Gilad等[35]也发现孕妇血浆中miR-526a、miR-527、miR-520d-5p的含量比正常人高出数百倍，分娩后即下降，因此建议以这3条miRNA的含量来判断孕妇是否妊娠，并可用于异位妊娠的诊断。

3.2.2 组织器官损伤

3.2.2.1 急性组织损伤 Laterza等[36]为了阐明血浆中组织特异来源的miRNA能作为组织损伤特异标志物的概念，制备了3种组织特异损伤的动物模型，分别对骨骼肌特异的miR-133a、肝组织特异的miR-122，以及脑组织特异的miR-124含量进行血液检测，发现miR-133a和miR-122分别在骨骼肌和肝组织损伤后明显增高，升高倍数达到数百倍至数千倍，而此时传统的骨骼肌损伤和肝损伤标志物肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 丙氨酸转氨酶 （alanineaminotransferase，ALT）、 天冬氨酸转氨酶 （asparate eaminotransferase，AST）轻度增高或增高数十倍，结合病理染色，发现miR-122诊断肝损伤的敏感性要优于ALT。同时，在大恼中动脉闭塞后8 h的大鼠血浆中能明确检测到脑组织特异的miR-124的增高，24 h增高的更加明显。这些研究结果不仅表明骨骼肌、肝组织、脑组织特异的miRNA能作为骨骼肌损伤、肝组织、脑组织损伤特异标志物，并且可拓展至所有组织特异的miRNA都能作为该组织损伤特异标志物的科学概念。

3.2.2.2 肝损伤 Wang等[37]比对恼、心、肝、脾、肾、肺6个组织和血浆miRNA的表达谱，发现血浆中miRNA的来源非常广泛，然后利用过量对乙酰氨基酚（acetaminophen）灌胃制备药物性肝损伤小鼠模型，在造模24 h的时候，对损伤前后肝组织、血浆中miRNA的表达谱进行比对，发现共有20个miRNA在肝组织和血浆中均存在明显变化，其中17个具有相反的改变趋势，其中miR-122、-192在造膜后血浆中明显增高而肝组织中显著降低；随后针对miR-22、-101b、-122、-133a、-135*、-192、-193和-486进行了时间和计量的深入研究，发现这些miRNA在血浆中的含量和对乙酰氨基酚灌胃呈现很好的时间、剂量依赖性；不仅如此，肝脏特异的miR-122和-192能在150 mg/kg对乙酰氨基酚灌胃1 h的时候就能在血浆中检测到显著的升高，而血浆中ALT的含量尚未有明显的改变，说明血浆miRNA反映肝脏损伤的灵敏度要优于ALT。新近研究发现肝炎、肝硬化患者血中miRNA-192、-122含量较正常人明显升高[38]，用实时荧光定量Ri-PcR检测慢性乙肝及肝病患者血清中miR-21、miR-122、miR-223，显示比健康人显著升高，且乙肝患者比肝病患者升高更显著，因此，推测这些miR可作为乙肝患者肝损伤的分子标志物[38]。

3.2.2.3 急性心肌损伤 JI等[39]为研究心脏组织特异miRNA能否作为心肌损伤的标志物，首先比对了心、肾、肝、骨骼肌miRNA表达谱，发现miR-208和-490在心脏特异高表达，在随后多种组织的定量PCR验证过程中，发现miR-208是严格意义心脏特异表达的miRNA，并以此为备选标志物；然后利用异丙肾上腺素（320 mg/kg）皮下注射的方法制备了急性心肌损伤大鼠模型，在不同时间点进行了血浆miR-208定量检测，绘制了含量--时间变化曲线，同时与肌钙蛋白比较发现miR-208在造模3 h即能在血浆中检测到显著性增高，这种增高一直持续至12 h，在24 h后血浆miR-208的含量呈现下降趋势；同时在急性肾梗塞、心肌肥厚的动物模型中没有发现血浆 miR-208的增高，提示心脏特异miRNA不仅可能是新颖的心肌损伤监测标志物，同时还提示了在某些肌钙蛋白升高的非心梗疾患中的应用前景。AI等[40]则针对心肌组织高表达，同时在心肌缺血后会表达增高的miR-1，对急性心梗人群和非心梗人群血浆中的含量进行了研究，他们发出miR-1在急性心梗人群中的含量要高于非心梗人群，其含量和心电图QRS波的宽度存在正相关性，提示血浆中心脏高表达的miRNA可作为急性心梗诊断新的标志物，可能对急性心梗的预后判断具有一定的价值。

Wang等[41]从理想的心肌标志物的特征出发，筛选了心脏特异高表达而血浆中缺乏或含量微弱的miRNA作为候选标志物，包括miR-208a、-499、-133a和-1，利用开胸结扎前降支的方法制备了急性心梗动物模型，发现这4个miRNA在冠脉结扎1 h后均能检测到明显的增加，在6～12 h血浆中含量达到高峰，24 h的时候显著下降，结合miRNA的表达谱以及单纯开胸不结扎冠脉的假手术组血浆中miR-133a、-1和-499也出现不同程度增加的现象，他们认为心脏特异的miR-208a是一个较好候选标志物。随后在小样本的人群中，研究发现血浆中这4个miRNA的平均水平在急性心梗人群中显著高于非心梗人群，这种差异能有效地区分心梗人群（ROC分析曲线下面积均在0.8以上）；尤其是miR-208a，在非心梗人群中检测不到 （PCR结果CT值>40），而在90.9%（30/33）的心梗人群中能检测到显著增高。进一步对急性心梗人群按照胸痛时间进行亚组分析时发现，在胸痛4 h以内miR-208a对急性心梗的检出率要高于肌钙蛋白，提示血浆miRNA很可能作为急性心梗新的诊断标志物。

3.2.3 心力衰竭 通过定量PCR检测心衰（HF）患者的血浆miRNA表达谱并和健康志愿者相比对，发现仅有miR-423-5p和-18b*能在胸闷患者中区分HF和非HF，进一步研究发现miR-423-5p和血清中脑钠肽 （brain natriuriceptide，BNP） 存在正相关 （R=0.43，P=0.002）， 和左心室射血分数（EF%）存在负相关（R=0.34，P=0.023），提示血浆miR-423-5p是一种有潜力的心衰分子标志物[42]。

3.2.4 败血症 Vasilescu等[43]首先对比了败血症患者白细胞miRNA表达谱，发现在所有败血症患者中均出现变化的miRNA有4个，miR-150和-342-5p均下调，miR-182和-486均上调；进一步研究发现血浆miR-150的含量和患者序贯性器官衰竭评分 （SOFA）分值呈负相关，其中促炎因子TNFa和抗炎因子IL-10-IL-18在败血症患者的血浆中均显著上升，其含量和miR-150的血浆含量呈负相关，利用血浆IL-18和miR-150的比值，进一步可以区分miR-150含量不同的败血症患者。Wang等[44]经过综合研究发现，血液中miR-146a和-223含量能有效的区分感染和非感染原因导致的败血症和系统性炎症反应综合征（SIRS）患者，当特异度为100%时，其灵敏度分别是63.3%和80%。

4 microRNA作为肿瘤标志物的应用

4.1 优势 检测时损伤小、稳定性好、灵敏度高、可用于早期肿瘤的检测。

4.2 缺点 血清中miRNA的含量较低，一般方法学不易检测。

4.3 方法学 寻找一种灵敏度高、操作简单且成本低廉的检测方法，这是血清miRNA应用于肿瘤临床检测急待解决的问题。

4.4 选择合适的内参 内参的稳定性，决定了检测结果的可靠性，以消除样品间RNA含量的差异。目前可供选择的内参如：RNU6B,miR-16，miR-24，miR-142-3P，人工合成的外源miRNA及总 RNA等。若同时检测几种 miRNA，用geNORM，NormFinder，Bestkeeper和REST等软件进行分析，选择一种或多种变异度较小的miRNA作为内参[45]。

4.5 检测技术 电化学传感器检测技术的使用，该方法检测灵敏度可达到0.1 pmol，足以满足检测血清miRNA的条件[46]。且实时荧光定量PCR技术也是一种优越方法。

4.6 选用上调标志物 优先选择在肿瘤中表达上调的血清miRNA，这样可提高检测的灵敏性和特异性[47]。

4.7 多种标志物联合使用 仅仅采用一种血清miRNA作为肿瘤标志物往往特异性不足，若将多种miRNA组合使用并与其它类型肿瘤标志物检测相结合，可望显著提高诊断的准确性。

4.8 变异性 个体间血清miRNA变异较大，探寻肿瘤发生发展的不同时期个体血清miRNA表达谱的变化规律并阐明作用机理，是将miRNA检测应用于恶性肿瘤个体化诊断的一个关键问题。

总而言之，很早以前人们致力于血清中疾病标志物的研究，但多因不够稳定和特异性差而临床应用前景并不乐观。然而miRNA最新的研究结果却令人惊喜，miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性，这些特异性表达既是其功能研究的基础，又是很好的疾病标志物。Chen[48]利用更加灵敏、特异的高通量测序技术，对血清中所有 18～30 nt的小片段RNA进行了检测，发现在男性和女性血清中分别有100种和91种miRNA。在不同的环境条件下miRNA在血中仍保持相对稳定，显示了作为理想的疾病标志物所需的某些特征，开创了血中miRNA研究的先河。不仅如此，在血液之外的其他体液，如：唾液、痰中以miRNA作为肺癌、口腔肿瘤标志物的研究也显示了很好的价值。血液中miRNA作为新兴的肿瘤分子标志物在未来的肿瘤临床诊断和治疗中将会显示更好的应用前景[49]。相信随着研究的深入和拓展，将会发现越来越多的血清miRNA作为疾病诊断和预后的标志物，同时血清miRNA的功能研究，必将成为标志物研究之后的又一大热点。

[1]Zhang B,Pan X,Cobb G P,et al.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].Dev Biol,2007,302（1）:1-12.

[2]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-97.

[3]温旺荣，李 莉，陈文景.MicroRNA及其在医学中的应用[J].分子诊断与治疗杂志，2010，2(1):1-4.

[4]Harfe BD.MicroRNAs in vertebrate development[J].Curr Opin Genet Dev,2005,15(4):410-415.

[5]Bethke A,Fielenbach N,Wang Z,et al.Nuclear hormone receptor regulation of microRNAs controls developmental progression[J].Science,2009,324（1）:95-98.

[6]Hirnshi IS,Kaoru Y,Koichi S,et al.Modulation of microRNA pocessing by p53[J].Nature,2009,460（4）:529-533.

[7]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-8.

[8]Michael A,Bajracharya SD,Yuen PS,et al.Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers[J].Oral Dis,2010,16(1):34-8.

[9]Zernecke A,Bidzhekov K,Noels H,et al.Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection[J].Sci Signal,2009,2(100):ra81.

[10]Hafner M,Landgraf P,Ludwig J,et al.Identification of micro-RNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing[J].Methods,2008,44(1):3-12.

[11]Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

[12]Cho WC.OncomiRs:the discovery and progress of microRNAs in cancers[J].Mol Cancer,2007,6(1):60.

[13]Ventura A,Jacks T.MicroRNAs and cancer:Short RNAs go along way[J].Cell,2009,136(6):586-591.

[14]Dews M,Homayouni A,Yu D,et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster[J].Nat Genet,2006,38(8):1060-1065.

[15]He L,He X,Lowe S W,et al.MicroRNAs join the p53 network-another piece in the tumour-suppression puzzle[J].Nat Rev Cancer,2007,7(5):819-822.

[16]Kumar M,Lu,Takwi.Negative regulation of the tumor suppressor p53 gene by microRNA[J].Oncogene,2011,30(7):843-883.

[17]Mitchell P S,Parkin R K,Kroh E M,et al.Circulating micro-RNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(9):10513-10518.

[18]El-Hefnawy T,Raja S,Kelly L,et al.Characterization of amplifiable,circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics[J].Clin Chem,2004,50(4):564-573.

[19]Valadi H,Ekstrom K,Bossios A,et al.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J].Nat Cell Biol,2007,9(5):654-659.

[20]Ng EK,Chong W W,Jin H,et al.Differential expression of microRNAs in plasma of colorectal cancer patients:a potential marker for colorectal cancer screening[J].Gut,2009,58(9):1375-1381.

[21]Huang Z,Huang D,Ni S,et al.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J].Int J Cancer,2009,127(1):118-26.

[22]Wang J,Chen J,Chang P,et al.MicroRNAs in plasma of pancreatic ductal adenocarcinoma patients as novel blood-based biomarkers of disease[J].Cancer Prev Res:Phila Pa,2009,2(9):807-13.

[23]Tsujiura M,Ichikawa D,Komatsu S,et al.Circulating micro-RNAs in plasma of patients with gastric cancers[J].Br J Cancer,2010,102(7):1174-9.

[24]Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other disease[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

[25]Hu Z,Chen X,Zhao Y,et al.Serum microRNA signatures identified in a genome-wide serum microRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2010,28(10):1721-6.

[26]Kitamoto S，yamada，Yokoyama S，et al.DNAmethylatm and histne HBKP modifcatima contribute to much expression[J].Giycobiology，2011，21（2）：247-256.

[27]Cho WC.MicroRNAS:potential biomarkers for cancer diagnosis prognosis and targets for therapg[J].Tnt T Biochem Cell Biol,2010,42(12):1273-1281.

[28]Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2008,141(5):672-5.

[29]Tanaka M,Oikawa K,Takanashi M,et al.Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patients[J].PLoS One,2009,4(5):e5532.

[30]Zhu W,Qin W,Atasoy U,et al.Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects[J].BMC Res Notes,2009,2(1):89.

[31]Heneghan HM,Miller N,Lowery AJ,et al.Circulating micro-RNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer[J].Ann Surg,2010,251(3):499-505.

[32]Michael A,Bajracharya SD,Yuen PS,et al.Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers[J].Oral Dis,2010,16(1):34-8.

[33]Chim SS,Shing TK,Hung EC,et al.Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma[J].Clin Chem,2008,54(3):482-90.

[34]Jopling CL,Norman KL,Sarnow P.Positive and negative modulation of viral and cellular mRNAs by liver-specific microRNA miR-122[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2006,71(3):369-376.

[35]Gilad S,Meiri E,Yogev Y,et al.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS One,2008,3(9):e3148.

[36]Laterza OF,Lim L,Garrett-Engele PW,et al.Plasma micro-RNAs as sensitive and specific biomarkers of tissue injury[J].Clin Chem,2009,55(11):1977-83.

[37]Wang K,Zhang S,Marzolf B,et al.Circulating microRNAs,potential biomarkers for drug-induced liver injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(11):4402-7.

[38]Bai H,Xu R,Cao I,et al.Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating piEN expression in the leukaemia k562 cell line[J].FEBs Lett,2011,585(2):402-408.

[39]Ji X,Takahashi R,Hiura Y,et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury[J].Clin Chem,2009,55(11):1944-9.

[40]Ai J,Zhang R,Li Y,et al.Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,391(1):73-7.

[41]Wang GK,Zhu JQ,Zhang JT,et al.Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans[J].Eur Heart J,2010,31(6):659-66.

[42]Tijsen AJ,Creemers EE,Moerland PD,et al.MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure[J].Circ Res,2010,106(6):1035-9.

[43]Vasilescu C,Rossi S,Shimizu M,et al.MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis[J].PLoS One,2009,4(10):e7405.

[44]Wang JF,Yu ML,Yu G,et al.Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,394(1):184-8.

[45]Lusi EA,Passamano M,Guarascio P,et al.Innovative electrochemical approach for an early detection of microRNAs[J].Anal Chem,2009,81(13):2819-2822.

[46]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-8.

[47]Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

[48]Jayaswal V,lutherborrow M,Ma DDF,et al.Idenificat of micro-RNA-mRNA modules using microarray dat[J].BMC(cenomics),2011,12(1):138-14.