酸-酶共促凝乳的研究进展

文 / 李依璇 刘显庭 张 昊 郭慧媛 任发政 中国农业大学教育部-北京市共建功能乳品重点实验室

图1 酪蛋白凝胶形成过程中存在的4 种重排形式

凝乳是干酪生产的关键环节之一，凝乳的好坏直接影响到干酪的品质，因此有关凝乳的研究一直是乳制品加工研究的热点。目前，在部分酸凝干酪中，如农家干酪、夸克干酪的生产过程中会加入少量的凝乳酶以促进凝乳，这种凝乳方式为酸-酶共促型凝乳。尽管酸-酶共促凝乳对新鲜干酪的生产极其重要，但有关酸-酶共促作用的研究直到近些年才有所报道。本文在概述酶凝、酸凝的基础之上，对酸-酶共促凝乳的性质及影响等研究进行了论述，以期明确酸及凝乳酶在促进凝胶形成过程中的作用。

1 酶凝乳及酸凝乳概述

酪蛋白是形成凝乳的主要成分，在自然状态下，牛乳中的酪蛋白多以胶束的形式存在，粒径为20～300 nm，由αs1-，αs2-，β-，κ- 这4 种酪蛋白组成，其中κ-酪蛋白几乎全部覆盖在胶束的表面，通过其C末端的亲水性与胶束表面的负电荷结合，从而使整个酪蛋白胶束稳定地溶解在牛乳当中[1]。

1.1 酶凝乳

酶凝乳是通过向牛乳中添加凝乳酶水解κ-酪蛋白的C末端，从而降低胶束之间的空间位阻，导致胶束发生聚集作用[2]。凝乳酶从牛的皱胃中提取，主要由胃蛋白酶与皱胃酶组成，能特异性地分解κ-酪蛋白的肽键Phe105-Met106，从而导致凝乳的形成[3]。酶凝乳的形成过程可分为3 个阶段。第一阶段，在凝乳酶的作用下，κ-酪蛋白分解为副κ-酪蛋白与酪蛋白巨肽（CMP），亲水性CMP随着乳清的排出而从胶束中释放出来，使得酪蛋白表面负电荷减少，空间位阻降低[4]。当κ-酪蛋白的酶解程度达到70%时，酪蛋白胶束的稳定性下降，酶凝进入第二阶段[5]。在此阶段，酪蛋白之间通过疏水键形成三维网状结构，并通过Ca2+架桥作用形成凝胶。第三阶段，乳清因脱水收缩作用而从酪蛋白网状结构中析出，凝乳形成。凝乳的形成主要由不同长度尺寸下网状结构的重排造成，酪蛋白凝胶不同形式的重排如图1所示。其重排形式主要有4 种，即分子与亚微粒子融合成颗粒（a）、颗粒间重排（b）、颗粒间形成链条（c）及肉眼可见的脱水收缩（d）[6]。在凝乳过程中，几乎所有酪蛋白都参与重排过程，从而逐渐形成凝胶的稳定结构。

1.2 酸凝乳

对于酸凝乳来说，主要是通过pH值影响酪蛋白胶束的性质[7]。随着pH值的降低，酪蛋白中的胶体磷酸钙（CCP）从中释放，酪蛋白表面的负电荷被中和。当pH值达到等电点4.6附近时，酪蛋白聚集沉淀，形成多孔而松散的聚集体。目前有关酸凝乳形成的机理尚未阐明，至少有3 种假设的模型[8]，即分形模型、浸透模型、胶球模型，且3 种模型均只能部分解释凝乳的过程。如分形模型是利用分形理论解释酸凝形成过程中，凝乳性质、结构、组分的变化，此种模型能有效地将酪蛋白凝胶的部分性质，如流变学性质定量化，却不能解释聚集体的重排及渗透。

酸凝乳过程中随着pH值的降低，凝乳的物化性质发生显著性变化。在pH值从6.7到6.0的过程中，酪蛋白表面负电荷降低，使得静电排斥降低。由于只有少量的CCP会从酪蛋白胶束中溶解出来，酪蛋白胶束大小不变。在pH值从6.0到5.0的过程中，随着进一步酸化，酪蛋白之间的静电斥力与空间位阻明显下降，酪蛋白毛发层收缩。同时，pH值的下降使得酪蛋白的离子化作用减弱，从而降低其表面势能，最终导致Ca2+与无机磷酸盐的溶解释放，当pH值为5.0时，CCP全部溶解释放。在pH值从5.0到4.6的过程中，酪蛋白胶束随着进一步酸化而瓦解，pH值达到等电点时，酪蛋白表面的负电荷被中和，静电斥力减弱，使得β-，κ-酪蛋白的两亲性减弱。又由于CCP的释放，酪蛋白之间的静电引力加强，使得αs-酪蛋白聚集最终通过簇团连接成三维网状结构的凝胶[9]。

2 酸-酶共促凝乳的过程及相关变化

2.1 酸-酶共促凝乳的过程

在酸-酶共促凝乳过程中，酸与凝乳酶为协同作用，酸化加强了酶解酪蛋白的聚集趋势，凝乳酶的作用可减少酸化过程中去矿化对凝胶粘结力的负面影响，最终使凝胶结构加强[10]。凝乳酶与酸共同促进凝乳的过程可分为以下几步[11]：（1）加入发酵剂，酸化至凝乳酶作用所需pH值。（2）加入凝乳酶，凝乳酶作用初始阶段开始，κ-酪蛋白发生水解。（3）凝乳酶作用第二阶段，酪蛋白胶束聚集与凝胶形成，凝乳粘度增加。（4）酶凝乳型转变为酸凝乳型凝胶，并伴随微孔脱水作用；局部形成凝胶网络，使凝胶孔径增大[12]，从而导致粘度减小。（5）酸凝作用占优势，酸凝胶形成，粘度第二次增加。（6）脱水收缩作用，酪蛋白收缩，导致微孔收缩（无乳清析出），接着大量的脱水收缩（可见乳清析出），粘度第二次减小。

由以上阶段可知，酸-酶共促凝乳过程实际分为酶凝为主、酸凝为主的2 个过程，凝乳的物化性质也呈现出明显的层次。

2.2 酸-酶共促凝乳过程中物化性质的变化

在酸促凝乳过程中，酸的作用使体系发生了2 个方面的变化，即酪蛋白表面负电荷的减少与胶体磷酸钙的逐渐溶解。这一变化影响了酪蛋白的亚稳定性，导致其结构重排，最终形成稳定状态的凝胶[13]。酸-酶共促凝乳过程中的物化变化与以上所述酸凝过程相似，但也存在着一些不同。少量凝乳酶的添加并不影响胶体磷酸钙从酪蛋白中的分离，但会导致β-酪蛋白分离最大值出现延迟[14]。在酸-酶共促凝乳中，pH值从6.7降到4.6，酪蛋白的容积度与溶解性缓慢降低。在酸凝乳中，容积度与溶解性的最大值在pH值5.3时出现，酶凝乳则为pH值5.6。

在粘度方面，酸酶共促凝乳的粘度随时间的变化而变化，当粘度值达到局部最大值后凝乳的硬度将下降。这是由酶凝胶形成时的去矿化作用造成的，这一过程完成在pH值5.3到5.1范围内[15]。流变学性质方面，以pH值5.2为分界点，若凝胶形成时pH值>5.2，则其流变学性质更趋向于酶凝胶。若凝胶形成时pH值<5.2，则其流变学性质更趋向于酸凝胶。当pH值为5.2时，酶凝胶有非常高的渗透系数与损失正切值，说明蛋白质之间的相互连接逐渐弛缓[16]。

酸酶共促凝乳过程中，凝乳由酶凝型逐渐转变为酸-酶凝型。在此期间，由于微孔脱水作用，使得凝胶网络结构粗化，达到粘度与凝胶模量的局部最小值[17]。在微孔脱水作用过程中，凝胶网络结构部分位置逐渐紧密，部分位置逐渐松散。随着pH值的降低，孔径及渗透系数增加。

当在酸化初期加入少量的凝乳酶时，低pH值加快了酶解反应的速度，形成粗糙的网状结构，从而形成更高强度的凝胶。由于酪蛋白部分熔合，搅拌时酸酶凝胶较酸凝胶更加粘稠[18]。在不同的农家干酪的生产过程中，酸凝凝块中酪蛋白颗粒较酸-酶凝颗粒小。与pH值=4.6的酸凝胶（损耗正切值tanб=0.27）或酸-酶共促凝胶（tanб=0.26）相比，pH值=6.7的酶凝胶[19]（tanб=0.60）更加粘稠。由于tanб与蛋白质之间的连接张弛程度有关，且酶凝凝胶更易脱水，因此随着凝乳酶溶度的增加，酸-酶共促凝胶的脱水作用显著增强[20]。

2.3 影响酸-酶共促凝乳的主要因素

2.3.1 凝乳酶的浓度

目前，在夸克干酪与特沃劳格干酪的生产过程中，都会加入少量的凝乳酶以改善凝块排水的能力，减少酪蛋白细屑的产生，增加凝块的强度[21]。夸克干酪生产中凝乳酶的用量为2～20 mL标准活力的凝乳酶/1000 L牛乳。凝乳酶的添加使酪蛋白在酸化过程中更易聚集，酸化初期酪蛋白凝集部分与未凝集部分的比值增加。如果夸克干酪仅用酸化生产，则凝乳切割点在pH值4.5～4.7范围内，而加入少量凝乳酶后由于酶解生成的副κ-酪蛋白的等电点高于κ-酪蛋白，凝乳切割pH值变为4.8～4.9[22]。因此，可以通过添加酶防止过度酸化。然而凝乳酶能分解蛋白质产生多肽类的苦味物质，从而导致夸克干酪的苦味产生。因此需加入合适浓度的凝乳酶，在提高凝乳酶作用的同时降低苦味的形成。

研究表明，凝乳酶的添加缩短了凝乳时间，凝胶形成时pH值增大，凝乳酶浓度与凝乳时间及粘度局部极大值所用时间成负相关。在浓度0～20 mL/1000 L内，随着凝乳酶浓度的增加，凝乳开始时及粘度局部极大时的pH值分别从5.44增至6.31，5.05增至5.38。然而，在pH值6.45、30 ℃下加入凝乳酶，添加不同凝乳酶浓度后的凝乳粘度的局部最小值与最后的粘度最大值出现在相同的pH值，即分别为4.95与4.45，且粘度的局部最大值恒定不变。凝乳酶浓度达到1.7～2.2 mL凝乳酶/1000 L牛奶时，凝胶形成速度最快，此浓度被视为关键浓度[23]。当凝乳酶的浓度高于关键浓度值时，酸、酶凝胶过程中稠度将出现局部极大与局部极小值。在以大于关键浓度的量添加凝乳酶后，粘度曲线中的局部最大值的拐点、局部最小值、最大值都将有所降低。不仅酸-酶共促产生的凝胶硬度大，而且酸-酶共促凝胶的搅拌型产品，如夸克干酪的表观粘度比单独酸化时高，酸-酶共促夸克干酪的脱水收缩作用也强于单独酸化型夸克干酪[24]。

2.3.2 热处理

在干酪加工中，热处理是必不可少的生产环节之一。当热处理温度高于70 ℃时，乳中部分乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白变性，通过疏水作用、分子间二硫键作用与κ-酪蛋白之间形成复合物。变性的乳清蛋白增加了缔合反应的敏感性，使得乳清蛋白与κ-酪蛋白之间形成二硫键[25]。当加热温度为80 ℃时，乳清有30%发生变性，酸-酶共促凝胶的水合作用与表观粘度值显著增高。对于新鲜干酪，乳清蛋白变性的最佳程度为75%～80%。如果变性程度过低，干酪表现为柔软、不顺滑。相反，如果变性程度过高，如加热到120 ℃时蛋白质发生聚集，从而导致新鲜干酪的沙质感。因此，目前生产中多采用温度88～95 ℃，时间3～6 min的热处理。

目前，有关未经热处理酸酶共促凝乳的自动脱水收缩作用有较多的报道。共聚焦电子扫描显微镜结果显示，未经热处理的酸酶共促凝胶网状结构孔径大于经热处理的酸酶共促凝胶，且热处理后的凝胶网络连接较多。这一结果与渗透系数的变化一致。由于酸酶共促凝胶形成初期会发生聚集体的大量重排，使得未经热处理的酸酶共促凝胶更易自发地排出乳清[26]。

在纯酸凝过程中，随着热处理程度的加深，凝胶形成的速度不断加快，凝胶形成时的pH值增大。然而在酸酶共促凝乳热处理后，凝胶pH值点恒定在6.3，但粘度增长的局部极大值的pH值点从5.6降至5.0。热处理下，酸-酶共促凝胶粘度的初期增长将有所下降，这与酶凝作用的第二阶段相关。研究表明，在低凝乳酶添加下，热处理对酶凝作用的第一阶段酶解反应的进行影响较小[27]。热处理后，由于酪蛋白之间被乳清蛋白连接，使得酸-酶共促凝胶较未热处理凝胶硬度大。同时，由于脱水作用减弱，导致局部极大或极小值不显著。热处理后，tanб值由0.51降至0.43，说明酪蛋白的大量重排减弱[28]。

2.3.3 添加凝乳酶时的pH值

目前，在夸克干酪的生产当中，凝乳酶一般在发酵剂加入后60～90 min添加，此时的pH值为6.3。凝乳酶的添加时间点及其对干酪结构品质的影响主要靠经验判断，添加凝乳酶的pH值点从原乳pH值到6.00不等，主要集中在6.30～6.45。对于酶凝乳，降低pH值能显著地缩短凝乳时间，其最佳pH值为6.0[29]。随着pH值的降低，酪蛋白聚集开始所需的κ-酪蛋白转变为副-κ-酪蛋白的酶解程度逐渐降低，pH值6.7时为70%，pH值 5.6时为30%。同时，会导致酪蛋白聚集与凝胶形成的速度增加。这主要是因为低pH值下Ca2+的活力强，当pH值从6.8降至6.3时，酪蛋白的聚集速度增倍[32]。较低的pH值可能导致更快的聚集体的重排与胶团的融合，从而使弹性模量在凝胶点到平稳值期间的增长速度增加。随着pH值的降低，酸-酶共促凝乳所用的时间将明显降低[30]。在如下几个阶段中，凝乳有显著性的差异：（1）在pH值5.98～6.62范围内，加入低浓度凝乳酶时，凝乳时间随pH值的下降而显著缩短，而加入高浓度凝乳酶时，凝乳时间则与添加凝乳酶时的pH值无关。随着pH值的降低，酸酶共促凝胶的粘度局部极大值增加。（2）在pH值 5.8～6.6内添加凝乳酶，凝胶最终的粘度无显著性差异。然而最初的聚集反应受添加酶时pH值影响大。（3）在pH值低于6.0时，凝乳酶添加后粘度的局部极大或极小变得不显著。

另外，酸-酶共促的凝固点（pH值 5.63～6.40）、粘度值的第1 个拐点（pH值 5.17～5.65）及粘度局部极大值（pH 值5.02～5.16）与凝乳酶添加时的pH值（5.8～6.6）直接相关，而局部极小值、第3 个拐点（pH值4.8～4.85）及最后的极大值仅与酸化有关，与添加凝乳酶时的pH值无关。当pH值>5.9时，添加凝乳酶时的pH值并不影响粘度的局部极大值、极小值及最终极值的数量级大小。目前，有关添加凝乳酶时pH值如何影响最终酸酶共促凝乳所生产的干酪产品的流变学特性或脱水收缩的文献尚未见报道。

除以上因素外，影响酸-酶共促凝乳的因素还包括凝乳时的温度、超滤处理、发酵剂与Ca2+浓度等[31～33]，然而这些因素的作用较为复杂。有关Ca2+浓度对酸-酶共促凝乳影响的研究表明，只有当凝乳酶的添加量达到10 mL/1000 L时，才对酸-酶共促凝乳的形成产生影响。由于酸-酶共促凝乳影响的因素之间存在着一定的联系，因此还需进一步探讨多因素对酸-酶共促凝乳形成的影响。

3 小结与展望

由于酸-酶共促凝乳中涉及的反应与结构变化较为复杂，凝乳机制的研究较为困难。因此尽管酸-酶共促凝乳方式对于新鲜干酪的生产具有重要的指导意义，有关酸-酶共促凝乳的研究仍然较少，为进一步明确酸、凝乳酶在酸-酶共促凝乳中的作用，还需进行以下工作：（1）明确酸、凝乳酶在促进凝乳形成过程中所贡献作用的强弱大小的变化。（2）在增大凝乳酶量的情况下，研究酶量、酸量及特定质地凝块之间的关系，以期为获得特异性产品提供理论基础。（3）进一步加强热处理、凝乳酶浓度、添加凝乳酶时pH等因素组合对酸-酶共促凝乳影响的研究。

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