电喷雾电离四极杆质谱直接进样定性检测化合物实验条件的研究

赵逸松 宋学英 薛 冰

(首都医科大学医学实验与测试中心，北京 100069)

质谱分析具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快等优点［1］。对于表征有机化合物而言，第一步和最重要的步骤就是快速准确地确定相对分子质量，电喷雾电离四极杆质谱恰好满足了这样的要求，成为药物化学合成实验不可缺少的检测工具之一。本文中用到的质谱是Waters公司的型号为Quattro microTMAPI的电喷雾电离四极杆质谱，它的可测质荷比范围为2～2 000 m/z，适用于小分子化合物检测，所以可用于药物化学实验反应中间产物、目标化合物以及副产物的定性检测。

电喷雾电离是一种通用电离技术，在药物研究中可以成功地分析80%以上的有机化合物，因而成为表征药物分子的常用方法。电喷雾电离的原理是溶液经过一根高温和加有高电压的毛细管后形成雾状溶液，在强电场的作用下，雾状溶液的液滴带有过量同种电荷，在高温环境中随着液滴溶剂的进一步挥发，液滴逐渐变小，液滴表面电荷剧增。当电荷之间的静电排斥力与液滴的表面张力相等时，液滴发生崩解，形成更小的液滴，此过程反复进行，最终形成气相离子进入质量分析器［2］。

四极杆性能稳定可靠、造价低，是最常见的与电喷雾电离离子源连接的质量分析器，该分析器由四根平行的金属杆组成。四根金属杆分成2组，一组加上直流电压，另一组加上具有一定振幅与频率的交流电压。只有质荷比适于四极杆电压和频率要求的离子才可以沿金属杆之间的轴线飞行到达检测器。不能满足这种要求的离子将与金属杆相撞，中和电性，成为不带电荷的气体分子被真空泵抽出系统。有规律地改变加在四极杆上的电压或频率，在检测器上便可记录到不同质荷比的离子信号，完成质谱测定［3］。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Quattro microTMAPI电喷雾电离四极杆质谱(美国，Waters公司);2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);软件为masslynx 4.0;1810-B型石英自动双重纯水蒸馏器(常州国华电器有限公司)。

甲醇为色谱纯(中国百灵威公司);实验用水为三蒸水;0.45 μm针式过滤器(英国Whatman公司)。实验样品为药物化学合成实验过程中得到的中间产物、目标化合物。

1.2 样品准备

取微克级样品用可挥发溶剂溶解，通常使用的溶剂为色谱甲醇、色谱乙腈、色谱异丙醇或超纯水，不具备制作超纯水的条件也可以使用三蒸水。对于甲醇、乙腈、异丙醇和水都不溶的少数样品可使用少量四氢呋喃或氯仿将样品溶解后用甲醇或乙腈稀释后再进样。

样品充分溶解后要根据溶剂选择有机相或水相针式过滤器对样品进行过滤，用过滤后的样品直接进样。

1.3 质谱条件

离子源为电喷雾电离源，毛细管电压为3 kV;锥孔电压根据样品性质在10～100 V之间调谐;源温度为120℃，脱溶剂气温度为350℃;脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流量为350 L/h，锥孔气流量为50 L/h;直接进样时将样品带入质谱的流动相水的比例为30%，甲醇的比例为70%，流速设为0.2 mL/min;进样量为 10 μL。

1.4 Quattro microTMAPI电喷雾电离四极杆质谱直接进样过程

(1)根据样品性质选择电喷雾电离的正负模式。

(2)用微量注射器取样品溶液约100 μL，将注射器固定在六通阀的接口上旋紧。

(3)按MS tune界面左下角Acquire按钮，在弹出对话框中，编辑扫描模式、样品名和扫描的质核比范围，按Start按钮开始采集离子流信号，按六通阀右侧Load按钮，推注射器进样约30～50 μL，然后按Inject按钮进样。

(4)在Chromatogram界面采集总离子流信号并去除本底离子流信号，在Spectrum界面得到质谱图。

(5)得到满意的质谱图后，点击MS Tune界面快捷按钮栏上的“手”标志按钮，终止离子信号采集进程。

(6)每做完一个样品，清洗微量注射器10～15次，清洗六通阀上的定量环3～4次。

2 结果

如果样品经过充分的分离纯化，样品能够充分溶解，样品的电离效率也比较理想，质谱的参数设置恰当的话，就可以得到一张比较理想的全扫描质谱图。可以看到待测样品的准分子离子峰就是基峰，杂质离子峰和噪音峰强度很弱，样品浓度较大时还可以看到强度较低的二聚体的准分子离子峰，相对分子质量较大的化合物还可以看到三聚体带两个电荷的准分子离子峰。锥孔电压参数设置恰当可以减弱目标离子的碎片离子信号强度，避免对全扫描质谱图解析造成干扰。但如果想进一步得到目标离子的碎片离子信息则还需要对目标离子进行子离子扫描，通过调谐碰撞室的碰撞能量获得理想的子离子扫描质谱图。

3 讨论

样品的浓度、基质、pH值、化合物的表面活性、流动相的流速、质谱参数等许多因素会对电喷雾电离的离子信号强度有影响［4-6］。以下是结合实际工作经验，对电喷雾电离四极杆质谱定性检测化合物的实验条件的探讨。

3.1 样品需要纯化

电喷雾电离非常灵敏，样品需要进行纯化，尽量消除样品和溶剂中的各种盐和杂质，避免化学噪声和电离抑制。

样品中盐的浓度太高会抑制电离，一般要求挥发性无机盐浓度应小于20 mmol/L，不挥发性无机盐浓度应小于5 mmol/L。

表面活性剂存在于洗涤剂中，使用洗涤剂洗过的瓶皿处理样品会将表面活性剂带入样品，表面活性剂虽然会降低液滴表面张力，能增加从喷雾液滴中释放出离子，但其又具有较高的质子亲和力，通过和样品离子争夺质子会降低样品离子信号的灵敏度。

此外样品中含有的不挥发物质可能会污染质谱元件，会对其他样品的质谱图造成干扰。例如药物化学有机合成的样品常常会有三乙胺存在，这种物质的相对分子质量为101 000，电喷雾电离正离子模式时在质谱图上会看到强度很高的质荷比为102的加氢的准分子离子峰，这种情况下如果想观察质荷比200以下的离子，就很困难，而且三乙胺会存留在质谱中较难除去对后面的样品质谱图造成的干扰，所以样品要尽量纯化。

3.2 所需样品量

样品量一般取微克级即可。样品量过少可能造成检测不到目标化合物或质谱图的基线噪音强度太高而影响谱图效果。样品量过多则会出现离子信号过饱和，离子源内电流过大产生放电现象损伤仪器，而且多余样品残留会污染质谱不易清洗，还会对后面的样品造成干扰。但有些样品离子化效率高，较低浓度下也能得到很好的离子信号，而有些离子化效率低的样品则需要适当加大浓度或调节pH值促使目标离子峰信号增强，这时则需要根据实际情况决定样品量。

3.3 样品的溶剂

溶解样品的溶剂通常使用甲醇、乙腈、异丙醇和水。甲醇、乙腈和异丙醇要选用色谱纯试剂，避免试剂中的本底离子对质谱结果造成干扰。建议使用超纯水，超纯水是应用蒸馏、去离子化、反渗透等技术生产出来的水，这种水中除了水分子外，几乎没有什么杂质。用于质谱分析也是为了避免水中的本底离子对质谱分析结果造成干扰。由于制造超纯水的成本较高，有的实验室不具备制造超纯水的条件，如果三蒸水中的本底离子没有对质谱结果造成干扰则使用三蒸水也可以。对于甲醇、乙腈、异丙醇和水都不溶的少数样品可以使用四氢呋喃或氯仿做溶剂，但这些溶剂会促使质谱的塑料管路和橡胶垫圈老化，所以要加少量这类溶剂将样品溶解后用甲醇或乙腈稀释后再进样。

3.4 样品的pH值

pH值是影响电喷雾电离的重要因素。有些样品通过调整pH值可以得到理想的目标分子离子峰。碱性化合物用正离子模式检测，可以用有机酸调整pH值，酸性化合物用负离子模式检测，可以用碱调整pH值。调整pH值的有机酸一般用甲酸或乙酸，碱一般用氢氧化铵。强腐蚀性和不易挥发的酸碱不能用，会损坏污染质谱元件。高效液相常用的三氟醋酸不能用，它会明显抑制阴离子电喷雾电离，而当三氟醋酸超过0.01%的水平时，也会在一定程度上抑制阳离子电喷雾电离。

3.5 样品的过滤

质谱的进样管路很细小，为防止溶液中的颗粒堵塞进样管路，样品充分溶解后要根据溶剂选择有机相或水相的针式过滤器过滤，用过滤后的样品进样。在选择针式过滤器的时候需要注意，需要先用空白溶剂用针式过滤器过滤后进样，查看过滤后的本底离子，有些滤膜使用溶剂过滤后会产生一些强度很高的本底离子，会对质谱结果造成干扰，影响化合物的分析。所以要选择对质谱结果本底干扰小的针式过滤器。

3.6 质谱参数的优化

用电喷雾电离四极杆质谱检测样品时需要对离子源参数进行优化调谐，调谐的目的是得到较强的目标分子离子峰。当用电喷雾电离四极杆质谱进行液相色谱质谱联用对化合物进行定量检测时，每一个离子源参数都要进行优化调谐。而利用直接进样的方式进行大量药物化学实验反应中间产物、目标化合物以及副产物等小分子化合物的快速定性检测时，如果每做一个样品都将所有参数优化一遍不但浪费样品而且十分耗时。所以直接进样时一般只需调谐锥孔电压，其他参数设置在相对合适的范围内通常就可以得到理想的结果。下面对部分可以调谐的参数做一下简要说明:

(1)毛细管电压:在探头内部的毛细管上加上高电压，高电压使样品液滴带上过量电荷，从而离子化。电压值过低会导致样品的离子化效率低，电压值过高则容易引起放电现象。通常在2～4 kV之间优化，直接进样时通常设为3 kV。

(2)锥孔电压:锥孔电压对电喷雾电离的信号强度影响较大，也是直接进样时通常需要调谐的参数。加大锥孔电压会增加离子间的碰撞，使离子进入检测器的速度加快，离子损失小，检测灵敏度高，离子信号增强，但会发生源内裂解，产生碎片离子。降低锥孔电压，则检测的灵敏度会变低，但产生的碎片离子会减少。通过实践发现一般相对分子质量在100 000～400 000的化合物锥孔电压可以在10～30 V之间优化，相对分子质量在400 000～700 000的化合物锥孔电压可以在30～50 V之间优化，相对分子质量在700 000～1 950 000的化合物可以在50～150 V之间优化。但有少数化合物并不符合上述规律，有的化合物相对分子质量较小却需要较大的锥孔电压才能得到理想强度的分子离子峰，而有的化合物相对分子质量较大却需要相对较小的锥孔电压，在实际工作中应该注意这样的情况。

(3)源温度:源温度设定主要根据进入质谱的流动相的流速大小和流动相含水比例高低来决定，如果流动相流速较大、流动相含水的比例高、不容易气化则需要较高的源温度。通常在80℃ ～120℃之间优化。直接进样时需要利用高效液相的流动相将样品带入质谱，通常将流动相水的比例设为30%，甲醇的比例设为70%，流速设为0.2 mL/min，源温度设为120℃。

(4)脱溶剂气温度:脱溶剂气温度设定也要根据进入质谱的流动相的流速大小和流动相含水比例高低来决定，如果流动相流速较大、流动相含水的比例高、不容易气化则需要较高的脱溶剂气温度。通常在120℃～300℃之间优化。直接进样时流动相水的比例为30%，甲醇的比例为70%，流速设为0.2 mL/min，脱溶剂气温度设在200℃。

(5)脱溶剂气流量:脱溶剂气主要的作用是去除溶剂。样品需要利用流动相带入质谱，如果流动相流速大、流动相含水的比例高、不容易气化则脱溶剂气流量应大些。通常在300～1 000 L/h之间优化。直接进样时一般设为350 L/h。

(6)锥孔气流量:锥孔气的主要作用是去除样品中的中性分子。通常在0～100 L/h之间优化。直接进样时一般设为50 L/h。

电喷雾四极杆质谱是环境监测、食品卫生、医药等领域中重要的检测工具［7-10］。有机化合物的定性检测是电喷雾电离四极杆质谱最基本的应用技术，掌握起来并不难。对于已知化合物，根据它的相对分子质量和化学结构特性就可以基本确定实验条件，得到较理想的质谱图。而对于未知样品则需要在正负电喷雾电离模式下都进行测定，根据结果再参考以上所述对实验条件进行进一步调整，最终得到理想的质谱图。

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［7］王绍楠，袁东.色谱-质谱联用技术在环境监测中的应用［J］.广东化工，2011，38(1):177-178.

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