Toll样受体与自身免疫性疾病关系的研究进展

马瑞敏 张国军 康熙雄

(首都医科大学附属北京天坛医院检验科，北京 100050)

自身免疫性疾病是由于正常免疫耐受被打破，导致识别自身抗原的淋巴细胞增生活化而引起组织结构和功能损害的一类疾病，其确切病因尚不清楚。Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)是近年来备受关注的一种模式识别受体，通过选择性地识别病原体中病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的保守结构，实现对入侵病原体的早期识别，激活天然免疫。TLRs信号还通过上调抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表面的共刺激分子及其分泌的炎性细胞因子，诱导T、B淋巴细胞向效应细胞分化，进而调节获得性免疫［1-2］。TLRs信号是机体抵抗外界感染的第一道防线，但信号的过度活化也可引起级联反应，打破机体对自身抗原的免疫耐受，促进自身免疫性疾病的发生发展。而随着对TLRs研究的深入，也将对自身免疫性疾病的治疗提供理论基础及新的药物靶点。

1 TLRs的种类及配体

TLRs是一类跨膜受体，现已在人和小鼠体内共发现13种TLRs［3］，主要分布于免疫细胞及同外界相通的腔道上皮细胞表面，在巨噬细胞、树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面的表达尤其丰富。TLRs通过识别相应的配体来激活免疫反应。在TLRs家族中，TLR1、2、6、10 主要识别细菌脂蛋白;TLR3、4、5 分别识别双链RNA、脂多糖、鞭毛蛋白;TLR7、8、9主要识别核酸分子;TLR11、12、13识别肌动蛋白样分子。

除外源性配体外，TLRs还可识别某些内源性分子。热休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)是第一个被发现的内源性配体［4］。Lehnardt S 等［5］发现，从中枢神经系统坏死或凋亡的细胞中释放出来的HSP60可通过TLR4信号途径诱导小胶质细胞合成神经毒性氮氧化合物，在野生型小鼠中，HSP60可促进轴突脱失和神经元凋亡，但在TLR4或其信号通路中下游蛋白髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)突变的小鼠中则无此作用。此后发现的内源性配体包括一些细胞内分子(如 HSP70、HSP90、高迁移率族蛋白1、尿酸等)、核酸(如polyI:C、dsRNA、鸟苷类似物、DNA/抗体复合物等)、细胞外基质成分(如透明质酸、硫酸肝素、纤黏连蛋白)等［6］。这些危险信号多来自损伤变性、坏死或凋亡的细胞，它们的发现提示TLRs有可能参与自身免疫耐受和免疫监视，对自身免疫病的发生起关键作用。

2 TLRs信号通路和功能调节

除了TLR3和部分TLR4的信号转导通路不依赖MyD88，多数 TLRs信号中都有 MyD88的参与。MyD88首先通过Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)与 TLRs相结合，接着募集下游信号分子白介素1受体相关蛋白激酶(IL-1R associated kinase，IRAK)4，IRAK-4 磷酸化激活 IRAK-1，随后活化肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFR-associated factor 6，TRAF6)。活化的TRAF6具有泛素连接酶的活性，能够结合泛素结合酶，这种泛素化降解可以活化 TGF-β 激酶(TGF-β activated kinase 1，TAK1)和 TAK1结合蛋白(TAK1 binding protein，TAB)。活化的TAK1会催化人核因子κB抑制物激酶β(human inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β，IKK-β)磷酸化，最终激活核因子(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，促进炎性因子的表达。而含Toll/IL-1受体接头蛋白分子(Toll/IL-1 receptor-containing adaptor molecule，TRIF)和TRIF相关接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)则介导了MyD88非依赖途径，TRIF对TLR3和TLR4的信号转导都相当重要，可以活化干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF-3)，随后合成干扰素 β(interferon β，IFN-β)，然后引起一些IFN诱导基因的表达，而TRAM仅在TLR4的途径中发挥作用［7］。

TLRs的激活一方面可通过刺激先天性免疫应答和提高获得性免疫反应来保护机体，但它引起的持续性炎性反应也会对机体产生损伤，自身免疫、慢性炎症及一些感染性疾病都与它有一定关系［8］。因此TLRs的激活必须受到严格的负调控，以保持免疫系统的稳定。可溶性的TLRs是一类胞外负调控因子，可封闭膜表面TLRs与配体的结合，抑制TLRs信号通路。跨膜负调控分子根据作用原理可分为促使连接复合体的解离，如肿瘤发生抑制物2可促使MyD88与MyD88-接头蛋白相似物(MyD88-adaptor like，Mal)解离;干扰功能复合体的形成，如单免疫球蛋白IL-1相关受体(single immunoglobulin IL-1 related receptor，SIGIRR)可分别与IRAK和TRAF形成复合体，从而干扰后两者形成复合物等。而胞内也存在众多负调控因子，主要以泛素化降解、去泛素化、竞争性抑制等方式行使负调控功能［9］。

3 TLRs与自身免疫性疾病

3.1 TLRs与系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病程反复、累及多种器官的自身免疫性疾病，其免疫学特征主要是产生高滴度的自身抗体，伴随抑制性T淋巴细胞减少及自身反应性B淋巴细胞增多，但机制尚未完全清楚。在SLE发病机制中，TLR7和TLR9起重要作用。实验［10］证明，SLE患者外周血单个核细胞TLR7 mRNA、TLR9 mRNA量高于正常对照组。Papadimitraki E D等［11］发现活动期狼疮患者外周血中表达TLR9的记忆B细胞和浆细胞比例明显高于稳定期患者，且此种B细胞的量与血清中抗dsDNA的量呈正相关，可能是凋亡细胞释放的内源性核酸分子通过TLR9刺激B细胞的免疫反应参与了SLE的发病。进一步的体外研究［12］显示，IgG2a在易患自身免疫性疾病的鼠AM14B细胞中表达，而DNA、含有DNA的蛋白质或RNA及含有RNA的蛋白质均可与IgG2a结合，进一步同B细胞受体(B cell receptor，BCR)结合，导致AM14B细胞增生。该研究证实足够数量的自身抗原与BCR结合后，通过TLR7、TLR9激活原本处于静止状态的自身免疫性B细胞，产生自身抗体。这些自身抗体可直接攻击组织器官发生坏死脱落，坏死的组织细胞成分又可继续作为TLRs的配体，激活更多的B细胞，从而形成正反馈循环。而在动物模型中，缺乏TLRs衔接蛋白MyD88的鼠则不能产生高滴度的自身抗体。

SLE 患者血清中干扰素 α(interferon α，IFN-α)浓度升高，而一些本身不伴有自身免疫性疾病的患者经IFN-α治疗后会出现抗核抗体、抗dsDNA抗体，甚至SLE综合征。人浆细胞样树突细胞(plasmacytoid den-dritic cell，pDC)被认为是产生 IFN-α 的主要细胞［13］。TLRs介导的pDC激活后，可分泌大量的IFN-α，IFN-α通过一系列反应，刺激自身反应性B细胞产生自身抗体，同时活化细胞毒性T细胞产生自身抗原。自身抗原、抗体构成免疫复合物，被TLRs识别，又可诱导新的IFN-α 产生［14-15］。TLRs 还可诱导合成 IL-1、IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α等，参与调节特异的免疫反应。

3.2 TLRs与自身免疫性肝病

自身免疫性肝病系机体自身免疫反应过度造成肝组织损伤的疾病，主要包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和变异综合征(proteus syndrome，PS)等，其发病可能与遗传易感性和分子模拟机制有关。近年来，TLRs在疾病中的作用受到关注。有研究［16］显示，AIH、PBC患者胆管上皮细胞表达TLR3高于正常人，而Zhao J等［17］发现在PBC患者肝组织中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)表达水平增高，对于敏感个体，LPS可能是PBC发病的一种诱导因素。在LPS的刺激下，PBC患者单个核细胞和胆管上皮细胞TLR4、NF-kB表达及产生的细胞因子明显增多，提示TLRs信号通路可能在PBC发病中起作用。

由于天然生成的CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)在维持外周免疫耐受中起重要作用，因此CD4+CD25+Tregs在自身免疫性肝病发病机制中的作用越来越受到重视。有研究［18］显示，给野生型小鼠注射TLR2配体可导致Tregs数量显著增加;Tregs暴露于TLR4配体LPS可诱导几种活化标志物(CD69、B7.1、CD44、CD38 等)的上调，并增强 Tregs的存活和增生能力;而用LPS治疗可使Tregs的免疫抑制能力增加10倍，LPS活化的Tregs可以有效控制初始CD4+T细胞活化及由此产生的疾病。这提示在自身免疫性肝病发病过程中，TLRs信号系统被激活，进而影响Tregs功能，参与疾病的发生。

3.3 TLRs与脱髓鞘性疾病

常见的自身免疫性脱髓鞘疾病包括累及中枢神经系统的多发性硬化(multiple sclerosis，MS)和累及周围神经系统的吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)。实验性自身免疫性脑炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)和实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)分别是其稳定的动物模型。这类疾病有共同的组织病理学特征，即血管周围的单核细胞浸润、脱髓鞘和水肿。研究［19］显示TLR9参与EAE的发病:在细菌、病毒感染或组织损伤的情况下，TLR9与配体结合激活APC，激活自身反应性T细胞，使其分化为效应细胞而导致EAE，随着病程的进展可以观察到，TLR9和MyD88缺陷动物则不发生EAE，提示TLR9和MyD88参与了EAE的发病。Zhang Z Y等［20］报道了在EAN鼠巨噬细胞中TLR2、CD14和HSP70都呈高表达，并与疾病严重程度相关联，而以其为基础的负向调控可能是控制疾病发展的免疫途径。Deng Y N等［21］则报道了EAN鼠坐骨神经中TLR9的高表达状态。也有研究［22］显示tlr4基因多态性与GBS发病易感性的关系，认为Thr399Lle是GBS中AMAN亚型的易患基因型。而对于MS和GBS患者，TLRs在发病中所起作用的相关研究则较少。

4 TLRs与自身免疫性疾病的治疗

TLRs在多种疾病的发生和发展中有着重要的作用，因此以TLRs及其信号通路为靶点的干预治疗也引起了研究者极大的兴趣。Barrat F J和同事［23］研究了一种人工合成的寡核苷酸，称为免疫调节序列(immunoregulatory sequence，IRS)。IRS 869是 TLR9活化的抑制剂，能与其特异结合而阻断TLR9及下游信号的激活。他们的研究显示，给小鼠注射免疫刺激序列(immunostimulatory sequence，ISS)和 D-半乳糖胺可以引起严重的炎性反应甚至在几天内死亡，但注射IRS 869后可明显减轻炎症并延长生存期，对TLR7的研究也得到了相似的结果。之后Barrat F J等［24］更进一步研究了可以同时抑制TLR7和TLR9的寡脱氧核苷酸序列(oligo-deoxynucleotide，ODN)，这些序列可减轻炎症，并抑制浆细胞样树突细胞产生IFN-α。给狼疮鼠注射ODN，发现抗核抗体产生减少，狼疮性肾炎减轻，生存期明显延长。

在TLRs信号通路下游可作为治疗靶点的蛋白包括MyD88、TRAF6、IRAK1和IRAK4等。两个研究小组分别发现抑制MyD88可以影响通路中激酶的磷酸化和NF-kB的激活，同时影响IRAK1和IRAK4的募集反应，这说明MyD88作为TLRs通路的中枢性介质，其抑制剂可有效拮抗异常的TLRs信号，降低炎性反应及 IFN-α 的产生［25-27］。Song K W 等［28］报道了 IRAK1和IRAK4的双重抑制剂RO0884可有效抑制IL-1β和TNF-α的产生，而通过RNA干扰技术发现，IRAK1与TNF-α的产生相关，IRAK4和IL-1β的产生相关。这提示IRAK1/IRAK4抑制剂可阻断异常信号通路，减少炎性细胞因子的产生，在自身免疫疾病的治疗中有重要的潜在价值。

5 展望

随着对TLRs信号通路认识的逐步深入，基于TLRs为靶点的治疗探讨也成为研究的热点。根据疾病的发病机制和发展阶段选择合适的TLRs激动剂或阻滞剂进行治疗是有效的，但也仍有一些问题需要解决:由于机体免疫反应的复杂性和TLRs影响的广泛性，基于TLRs的药物可能带来严重的不良反应，因此如何控制药物的治疗作用和不良反应之间的平衡是此类药物面临的关键问题;很多研究结果来源于动物模型，而TLRs在人类疾病中的作用还有待更进一步的研究。

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