衣康酸产业的现状与展望

何敏超，张 宇，许敬亮*，袁振宏

（中国科学院 广州能源研究所，中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室，广东 广州 510640）

衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸[1-2]，是世界上第五大有机酸（前四位依次为：柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸和苹果酸），是一种不饱和二元有机酸。其含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯睛等聚合，溶于水、乙醇等溶剂；能进行各种加成反应，酯化反应和聚合反应，是化学合成和化工生产的重要工业原料，被誉为有机酸领域中皇冠上的宝石。衣康酸的分子结构式：

其主要用途[3-4]如下：

a）衣康酸及其聚合物添加少量天然物质可制成高效除臭剂和具有除臭功能的塑料与纸张等特殊产品。

b）衣康酸与苯乙烯及丁二烯共聚可制成SBR乳胶（Styrene Butadiene Rubber，苯乙烯一丁二烯橡胶），可用于纸张涂膜、金属与混凝土涂料、油漆添加剂和地毯上浆等。

c）衣康酸与丙烯酸或甲基丙烯酸或其酯类聚合制成树脂，具有阻垢作用，可用于表面涂层及乳化漆。

d）衣康酸制成酯类可用于油漆、弱酸性离子交换树脂、润滑油添加剂、粘结剂和增塑剂、粉压塑料以及密封胶。

e）衣康酸用于其他衍生物可用作医药、化妆品试剂、润滑剂、增稠剂、除草剂以及改善丝毛纺织性能。

f）衣康酸是生产柠康酸、中康酸、衣康酸酐等的原料。

随着衣康酸所具有的独特性能日益被人们所认识，其应用范围正迅速扩大，因而衣康酸的潜在市场是不容忽视的，具有广阔的发展前景。同时随着衣康酸的生产技术进步和生产成本不断降低，衣康酸的应用领域将会越来越广泛。

1 衣康酸生产现状

目前，全世界每年的衣康酸产能达到8万t～10万t，我国是世界上衣康酸的最大生产国和出口国。我国从事衣康酸生产的企业有：青岛科海生物有限公司（2万t～5万t）、浙江国光生化股份有限公司（1.5万t）、济南华明生化公司（1.5万t）和成都拉克生物工程实业有限公司（0.2万t）。除此之外，尚有诸多待建的衣康酸生产项目，如：德州华茂生物科技有限公司拟投资1.3亿建设年产3万t的衣康酸。

2 衣康酸产酸菌株选育研究进展

衣康酸优良菌株的选育，既需要选择合适的微生物种类作为出发菌株，更需要产酸代谢途径的理论指导。惟其如此，才能够不断地选育出发酵性能优异的工业化菌株。

2.1 衣康酸发酵微生物种类

能生产衣康酸的微生物种类有很多[1，5]，如土曲霉（Asp.terrus）、衣康酸曲霉（Asp.itaconicus）、假丝酵母（Candida species）、红酵母（Rhodotrorula）、黑粉菌（Ustilago）、查尔斯青霉（Penicillum charlesii）和黑曲霉（Asp.niger）。但是，只有土曲霉的产酸能力可以达到工业化生产的标准。土曲霉属于半知菌纲、丛梗孢目、丛梗孢科。

2.2 衣康酸产酸代谢途径

表1 国内主要衣康酸厂家情况Table 1 Major itaconic acid manufacturers in China

表2 国外主要衣康酸厂家情况Table 2 Major itaconic acid manufacturers outside of China

衣康酸的生物合成机理主要有以下3种[5]：

葡萄糖经糖酵解途径和三羧酸循环合成柠檬酸之后，再脱水脱羧生成衣康酸，途径如下：

也有人认为可能直接由乙酰CoA和丙酮酸合成柠苹酸，再由柠苹酸失水生成衣康酸，途径简示如下：

无论是上边哪一条途径，总的反应式为：

上述反应式对糖的转化率为72%。由此可见，HAT418最高的糖酸转化率67.83%和NLYT-2-801的最高转化率69.1%似乎还有一定的提升空间。

乙酸和琥珀酸先缩合成三羧酸，再脱氢脱羧生成衣康酸，此种反应对于糖的理论转化率为48%，详细途径如下：

2.3 衣康酸产酸菌株选育研究进展

生物发酵领域中，优良的生产菌种是支撑起一个企业、乃至一个行业健康发展的基础和关键。目前，国内外在衣康酸产酸菌株选育方面已开展了大量卓有成效的研究工作，许多产酸菌株已经获得工业化应用，而且取得了不错的效果。

2.3.1 我国衣康酸产酸菌株选育

衣康酸产酸菌株的性能优劣，不仅取决于其产量高低，而且要求其在发酵周期、发酵最适温度、转化率和碳源利用能力方面都具有优异的性能。我国作为衣康酸的生产大国，与我国科研人员在衣康酸产酸菌株选育方面付出的艰辛劳动密切相关。经过我国几代科研人的研究开拓，目前已获得几株具有工业应用价值的产酸菌株。但迄今为止，我国衣康酸菌株都是利用传统的诱变选育技术获得的。

表3 我国衣康酸产酸菌株选育概况Table 3 Strain breeding for itaconic acid production in China

徐建春等[9]以土曲霉NLYT234为出发菌株，利用紫外、高温、氯化锂等诱变方法，成功选育到1株产酸水平达92.1g/L的菌株NLYT-2-801。刘建军等[10]以土曲霉No.201为出发菌株，经过紫外，亚硝基胍、高温、硫酸二乙酯等诱变，获得了菌株HAT418，其产酸水平高达81.4g/L～101.1g/L。其后，其在2006年进一步改造了HAT418，使其发酵周期减至40h，转化率维持在65%，玉米浆用量减少30%，硫酸根离子浓度减少5倍[11]。

菌株的转化率由菌株本身决定外，还受到外界因素的影响，如发酵温度。从表3可以看到，HAT418和NLYT-2-801的转化率都已经达到了63.18%～67.83%，产量也都超过了80g/L。而T730的转化率虽然达66%，但产酸水平却不足6.6%。因此，不能单纯的追求过高的转化率或者产量，而应该从产量、转化率和发酵周期等多个方面进行综合考虑。优良的产酸菌株应该体现在更短的发酵周期里达到最高的产量。

发酵周期从根本上决定了生产设备的利用率。因此，发酵周期长短是决定一个发酵菌株是否优良的关键。经过我国科研人员坚持不懈的努力，目前衣康酸产酸菌株的发酵周期已从原来的96h～144h减少至现在的40h[11]。另外，耐受高温也是优良菌株一个非常重要的特性。耐高温菌株在较高温度（38℃～42℃）条件下进行发酵，可以较大幅度地节省炎热夏季的冷却费用。如NLYT-2-801的发酵温度为40℃～43℃，HAT418的发酵温度也达34℃～38℃。

T730和15-UV-07都是以NRRL1960为出发菌，经过一系列不同的诱变方法，其产酸量和转化率也截然不同。T730的产酸量为6.6%、转化率为66%，而15-UV-07的产酸量为84g/L，转化率为52.5%。

2.3.2 国外衣康酸产酸菌株选育

目前国外已经报到的衣康酸菌株产酸水平普遍较低。较低发酵水平在28g/L～35.9g/L[12-13]，较高水平则为82g/L[14]。国外的菌株不仅在产量上与我国的菌株存在较大的差距，而且在发酵周期也存在着很大的差距。国外的产酸菌株发酵时间一般为144h～168h，而我国目前的工业化菌株发酵周期可不超过40h。

目前，国内外文献中利用产酸基因进行外源表达或者同源表达的研究较少，大多集中在代谢关键酶的机理研究。如6-磷酸果糖-1-激酶是糖酵解过程中关键的异构调节酶，能够磷酸化果糖-6磷酸生成果糖-1，6-磷酸。TEVŽ G等[15]将3种不同的表达载体转化土曲霉原生质体，这3种表达载体分别是pRCR-PFK1、pRCR-pfk10和pRCRmt-pfkA10。在父本菌株衣康酸产量为13.5g/L的情况下，含有pRCR-PFK1基因的转化子、含有pRCR-pfk10表达载体的转化子和含有pRCR-mt-pfkA10表达载体的转化子的产量分别是13g/L、23g/L和31g/L。研究结果表明，通过将修饰过的黑曲霉pfkA基因嵌入土曲霉，衣康酸产量得到了较大的提升。

顺乌头酸脱羧酶催化顺乌头酸转化为衣康酸，是衣康酸合成途径中最后一步的酶。KANAMASA S[16]分别从A.terreusIFO6365和A.terreusTN484-M1中提取编码顺乌头酸脱羧酶编码基因，去掉顺乌头酸脱羧酶基因的内含子后，构建了表达质粒pAUR-CAD1，并最终将该表达质粒导入S.cerevisiae中。实验结果表明，导入pAUR-CAD1质粒的菌株，顺乌头酸脱羧酶的活性为（276.1±30.1）mU/mg，而不含顺乌头酸脱羧酶质粒的菌株，顺乌头酸脱羧酶的活性仅为（37.9±8.4）mU/mg。除此之外，其另一个实验结果表明，顺乌头酸基因表达水平更高的菌株，其衣康酸产量更高。这个结论在衣康酸菌株选育方面具有积极的指导意义。

除此之外，也有研究者[17]将土曲霉的产酸基因导入黑曲霉进行表达，但最终的产酸量不到1g/L。

3 衣康酸发酵工艺研究概况

对于发酵性能优异的菌株，通过发酵工艺优化挖掘其发酵潜能具有积极的意义。菌株的优良的发酵性能可以较大幅度地降低发酵成本，并最终提升产品的竞争优势。我国衣康酸菌株的产酸水平、发酵温度和发酵周期无疑具有很强的竞争优势。

国外的发酵产酸水平最高为82g/L[4]，而我国衣康酸产酸菌株[18-25]水平大多为39.2g/L～101.1g/L，转化率为54.9%～69.71%，发酵周期为72h～168h，一些工业化发酵菌株的发酵周期可短至40h～47h。我国目前在应用的产酸菌株，其发酵最适pH值通常在2.0～3.0，也有采用自然pH值或pH值为4～5，发酵温度多为34℃～37℃。但耐高温菌株选育是今后的一个重点发展方向，能有效节约发酵生产成本。

目前，我国衣康酸的年产能在8万t～10万t，而且，随着衣康酸应用范围不断地扩大和深入，其需求量也将不断增加。因此，按照65%的转化率计算，我国衣康酸行业每年至少需要消耗12.3万t～15.38万t玉米。我国虽然是世界上最大的衣康酸生产国和出口国，但同时也是世界上最大的粮食进口国之一。早在2005年，我国就已经成为粮食净进口国。因此，积极探索衣康酸发酵生产的原料多元化途径就显得尤为必要。

目前，国内外研究人员已经着手开展利用其他碳源代替玉米淀粉生产衣康酸的研究。无锡轻工业学院[26]与广东雷州市越利衣康酸有限公司合作，建立年产1000t衣康酸工厂。该项目使用当地的木薯粉于1995年1月一次性试产成功，产品质量达到日本和美国的衣康酸质量标准。也有研究者[27]利用马铃薯淀粉、也有人采用玉米芯和麸皮[23]甚至NUBEL RC[18]等利用糖蜜、木质纤维素水解液进行发酵产酸研究进行发酵研究。但这些研究的发酵水平和发酵成本都远远不能符合工业化生产的要求。

刘建军等[1]认为，使用比较粗、成本低廉的原料生产衣康酸，虽然原料成本较低，但最终的生产成本并不低。采用精料可有效减少废渣的排放，更有利于产品的提取和回收。但考虑到我国粮食资源的短缺性以及木质纤维素原料来源的广泛性，未来利用农业废弃物进行发酵产酸探索和尝试无疑具有迫切的现实意义。

为了选育到能够利用农业废弃物发酵生产衣康酸的高产菌株，初步摸索了实验室保藏的5株衣康酸菌株的发酵性能。在利用100g/L蔗糖进行发酵时，菌B衣康酸的产量达到62.34g/L，菌E衣康酸的产量也达61.9g/L。不同的菌，其最佳的氮源并不一致。菌A、菌C、菌D和菌E最佳的氮源是硫酸铵，而菌B不能够利用无机氮源。另外，还发现了在pH值为2时，4个菌都不能产酸，菌E虽然能够产酸，但是产酸量较低。

4 总结及展望

1990年之前，我国的衣康酸还需要从美国和日本进口。如今，我国已经成为世界上最大的衣康酸生产国和出口国。而这一切离不开我国衣康酸科研人员在菌种选育方面所取得的突出成就，如康酸产量达81.4g/L～101.1g/L，发酵周期骤减至不到40h，转化率高达67.83%～69.71%，而且菌株耐高温的特性决定了在炎热的夏季进行发酵可以显著缩减降温费用。衣康酸工业菌株上述的这些特性，是我国衣康酸具有极强竞争力的关键。不过，由于我国人口众多，加之耕地面积持续锐减，因此，积极探索可替代来源于玉米淀粉的发酵碳源（如木质纤维素水解液、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等）就显得尤为迫切。国内外已经开展了利用农业废弃物发酵生产衣康酸的研究，并取得一些研究成果。随着可利用农业废弃物产酸菌株选育研究的开拓和提升，我国将会在生物质精炼衣康酸方面获得一些重大的突破。

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