单核苷酸多态性与舒尼替尼一线治疗进展期肾细胞癌患者的疗效、不良反应的相关性分析：一个多中心、观察、前瞻性研究（译文）

海南省人民医院泌尿外科 王忠尧 康新立

舒尼替尼是一个口服的酪氨酸激酶受体抑制剂，它的作用靶点是血管内皮生长因子（VEGF）受体、血小板源性生长因子、KIT、FLT-3、克隆刺激因子-1受体以及RET在一个随机的3期研究中，与一线治疗药物干扰素-a比较，舒尼替尼治疗进展性透明细胞肾癌，可显著改善无进展生存（PFS），5个月 vs 11个月，（P＜0.001），舒尼替尼已经成为当前肾癌标准治疗的选择。这些发现是有一些研究数据支持的，有研究显示舒尼替尼可能对总体生存（OS），有改善作用（干扰素-a vs 舒尼替尼=21.8个月vs 26.4个月，P=0.051），一个全球扩大性的超过4 500例患者参与的研究也得到了同样的结果。然而一些警告仍然存在，尽管大多数患者使用舒尼替尼可使疾病可控，但仍有20％的患者早期发生疾病进展和不良反应，导致8％的患者剂量保持不变，32％减量，38％发生推后使用药物。因为药物的暴露与药效有关，不良反应尽管不影响生命质量但是引起药物剂量的调整，剂量的调整会危及（或影响）药物的治疗效果 。确定舒尼替尼耐药或不良反应发生风险的相关性生物标记物能够有助于找出新的治疗方法并能提高治疗效果，尽管目前提出了多种药物耐药的不同机制，但是患者的遗传学背景仍发挥重要的作用，特别是舒尼替尼之类药物，不仅仅是直接的细胞毒性活性，它不仅与肿瘤的微环境有相互作用，而且与非恶性的内皮细胞相互作用。最近报道，高血压可作为舒尼替尼治疗效果可靠的生物标记，这一事实证实了这一假说即：舒尼替尼治疗的敏感性和药物耐药机制可能至少一部分是宿主依赖性的 。

因此本研究的目的就是确定舒尼替尼作为透明细胞肾癌的一线治疗药物时，影响药物治疗反应和不良反应相关的药代和药动有关的SNPs。

1 资料和方法

1.1 研究设计和患者选择

在西班牙生殖泌尿肿瘤中心所属的15个医院进行了观察、前瞻性研究，患者为成人（大于等于18岁）病理学诊断确诊是肾脏透明细胞癌，有局部和远处转移的患者，入组条件：患者之前没有接受过任何系统性治疗，包括细胞因子治疗，按照每日临床情况，接受有计划的舒尼替尼治疗。治疗方案是经过所有参与本研究或机构的医学伦理委员会审核并通过的，所有患者签署了知情同意书。

1.2 步骤

药物治疗时间表，药物剂量减量规则，以及放射学评估的时间均由参与研究的临床医生根据目前当地执行的临床指南来决定和制定。以特定的病例记录格式记录患者的人口学以及临床数据，该数据定期会有外部的监察员进行综合审查。患者样本进行2次匿名审查，一次是参与研究的医生，一次是西班牙国家肿瘤研究中心，进行分子生物学分析的研究者不知道患者的临床信息。

本研究检测了可能与舒尼替尼作用、代谢、以及转运有潜在关系的9个基因中的16个SNP，选择这些SNP多态性是基于之前的研究证据，之前报道的相关性：例如这些多态性会导致氨基酸变化以及不成熟等位基因发生率超过5％ 。这些被选择的可能影响舒尼替尼的药物动力学的多态性是位于编码舒尼替尼靶点和配体的基因上：包括[VEGFR2（rs2305948和rs1870377），VEGFR3（rs307826，rs448012和rs307821），PDGFR-a （rs35597368），VEGF-A（rs2010963，rs699947和rs1570360），IL8（rs1126647）]，这些SNP中的其中6个是受体中公认的功能性错义多态性，其中3个SNPs是之前报道的与贝伐单抗治疗反应以及肿瘤进展相关的（VEGF-A 5端非翻译区 和启动子变异体），1个是之前研究过的与帕唑帕尼治疗肾癌对PFS影响相关的SNP（是IL-8 3端非翻译区变异体），可能影响舒尼替尼的药物动力学的多态性位于与其代谢相关的基因上[CYP3A4（rs2740574）和CYP3A5（rs776746）和转录子ABCB1（rs1045642，rs1128503和rs2032582）和 ABCG2（rs2231142）]，CYP3A5*1是一个高度活跃的等位基因，然而CYP3A4中的SNP是舒尼替尼的主要代谢酶，是启动子变异体，但与已发表的报道其活性的结果相反。由于是转运子，已经报道ABCG2变异体增加了舒尼替尼的暴露率，曾有多个研究重复报道3个ABCB1的SNPs与可变性P-糖化蛋白的活性有关。

使用FlexiGene DNA试剂盒提取外周血DNA （厂家：Qiagen,Valencia,CA,USA），唾液中的DNA 提取使用DNA试剂盒（DNA GenotekOttawa,ON,Canada），根据生产厂家推荐的操作步骤进行,使用picogreen定量DNA 终浓度（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），使用KASPar SNP基因分析系统 对SNP进行分型（Kbiosciences,Hoddesdon,UK），使用7900HT序列检测系统（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）进行荧光检测和等位基因分配。

1.3 统计学分析

无进展生存（PFS）定义：时间计算是从舒尼替尼开始治疗的第一天到放射学疾病进展、明确的临床进展、或死亡之间的时间，患者在数据关闭时还未发生疾病进展的要在最后随访时进行审查。如果不能确定疾病进展的日期，在最后一次肿瘤评估时审查患者的PFS。总体生存（OS）定义：计算舒尼替尼开始治疗的第一天到患者死亡或者最后一次随访的日之间的时间。客观反应率由治疗的医生依据实体肿瘤治疗效果评估标准（RECIST） 1.0版本进行，分为：完全应答、部分应答、稳定、或疾病进展。评估的时间由各个临床研究中心确定，根据不良反应常见中终止标准的3.0版本（参考 webappendix p 1），参加治疗的医生对所有不良反应进行评估定级，以临床相关性以及分级的客观性为基础，结合3～4级不良反应，选择口腔黏膜炎，手足综合症，高血压，贫血，以及血小板减少等进行不良反应分析，同时也记录了因药物不良反应而引起药物减量以及发生的时间。

使用COX-回归分析检测了对应PFS和OS的SNP的基因型，使用logistic回归分析检测了对应RECIST反应的SNP的基因型，使用多参数分析法分析了包括PFS，OS，反应率等作为协变量与各种临床因素的相关性分析（与特定变量相关性是P＜0.1的临床因素就可作为那个特定变量的协变量），根据MSKCC预后分类以及多变量分析中的变量，我们将患者分为预后良好、中等、预后差三组，没有将参加研究的中心作为协变量，因为患者的数目在所有15个临床研究中心都比较少，都小于等于17，使用kaplan-Meier 方法以多参数分析法进一步分析了SNPs与PFS以及OS 的相关性。

使用舒尼替尼治疗天数（计算直到减少剂量）为变量的 COX回归模型，分析了与因药物毒性引起舒尼替尼减量的风险增加相关的基因型分析，不减量的患者在最后一次随访时进行审查，对于多参数分析，使用相关性P＜0.1的临床因素与剂量减少作为协变量，使用Kaplan-Meier法进一步在多参数分析中分析SNP与舒尼替尼减量的相关性 ，对所有患者以及起始剂量为50mg 组的患者做了此分析。以药物的不良反应进展作为次要终点，应用logistic回归分析研究了特定的舒尼替尼不良反应与基因型之间的相关性。多参数logistic回归分析包括相应结果作为协变量与临床因素之间的相关性分析（临床因素相关性P＜0.1）。我们使用更多的遗传模型检测所有基因类型。

保留缺失的数据作为MSKCC（纪念斯隆-凯特琳癌症中心）预后因素的缺失部分，剩下的一系列数据，最可能的价值是被分配到这些患者，使用Bonferroni方法纠正多重检验误差。对16个多态性进行分析，仅有在95％可信水平不经过矫正P＜0.0031被认为是有统计学意义。

所有的统计学分析使用 RStudion 的0.93版本进行。

1.4 资金资助的作用

研究的申请者不参与研究资料收集、分析、资料解释以及报告撰写。JG-D，LJL-G和CR-A可以接触到原始数据，JG-D、LJL-G、DEC和CR-A负责决定研究结果的提交发表。

2 结果

时间从2007年10月10日至2010年12月10日，募集患者共101例，关闭随访资料在2011年5月。剔除了6例患者，其中3例患者不能提供血液和唾液标本，2个不是透明细胞肾癌，1个是未接受舒尼替尼治疗。确定6个恶性肾脏肿瘤存在于6个其他患者中，但是亚型未确定，在舒尼替尼疗效分析中排除了这几个肿瘤患者（如包括89例患者），但是在不良反应分析中包括这6例患者（95例患者）。表1列出的是入选患者的临床特征，66个（69％）患者有多处转移，在白人中16个基因多态性分型的次要等位基因频率与其他报道的很相似，所有的SNPS是哈迪-温伯格（hardy-weinberg）平衡。

需要分配的变量 MSKCC 评分在18例患者中缺失（11例患者基线钙浓度，6例患者状态评分，1例乳酸脱氢酶浓度），一些患者尽管缺少一些资料，但是仍然能正确的被分配到 MSKCC 组，经过计算这些患者的最可能的值，15例患者分配到预后良好组，3例分配到预后中等组，替代或没有替代这些缺失信息所得到的结果是相当的，说明替代并没有使研究结果偏离。92（97％）的患者被划分为MSKCC风险评估中等和良好组（见表1）。94例患者是西班牙白种人，1例是非洲后裔，1例是亚洲（印度）后裔。

在经过中位21.2个月的随访（IQR8.4～25.6，95％CI 13.6～28.9），89例进行疗效分析的患者中，中位PFS是12.3个月（IQR 5.8～21.2,95％ CI 9.1～15.4），62例患者（72％）在进行分析时仍存活，在78例可测定疾病的患者中进行总体治疗反应评估，1例（1％）完全应答，36例（46％）部分应答，26例（33％）稳定，15例（19％）疾病进展。

在毒性分析中，最常见的1～3级不良反应是乏力67例（71％，67/95），黏膜炎 64例（67％），腹泻49例（52％），中性粒细胞减少 40例（42％），手足综合症 39例（41％），43例（45％）的患者发展成3级不良反应，47例（49％）因不良反应需要减量。没有报道4级不良反应。

与低评分和男性患者比，MSKCC高危因素评分高以及妇女患者的总体生存率和总体反应率差，但是PFS无差异 （webappendix p2），女性患者需要剂量减少的风险性更高，因为不良反应的发生率高于男性（P=0.005webappendix p3）。

表3显示，使用多参数COX回归分析了16个多态基因型的结果。2个VEGF3的多态性rs307826和rs307821，与PFS显著相关（见图1和表3），这个相关性在多重检验经过Bonferroni 校正后仍然有显著相关性，这些VEGFR3的多态性是，中等连锁不平衡是错义变异体（r2=0.55），很少有患者独立携带这些变异，这样，我们构建的模型表明根据这2个多态性基因型对患者PFS进行分组（webappendix p5），尽管在 P＜0.5的水平无统计学意义，但具有其他3个ABCB1、ABCG2和VEGFR2 （rs1128503、rs2231142和rs1870377） 的多态性的患者，舒尼替尼治疗反应PFS 或OS 相对差（见表3）。

表1 患者的临床特点

50例舒尼替尼药物减量的患者中47例（94％）是由于不良反应（webappendix P1）。为了检测与减量相关的因素，本研究分析了84例患者计算了从使用起始剂量为50mg到因为不良反应减量的时间。结果女性患者较男性更早减少剂量（P=0.005），并且多参数分析表明 CYP3A5 rs776746是重要的危险因素 （见图2和表4），并且经过多重检验后相关性仍具显著性。对所有95例患者重复进行了该分析，得到了相似的结果（资料未显示），三个变异等位基因（VEGFR2 rs1870377、VEGF-Ars699947和rs1570360）与高血压（见表4）发生风险增加可能成显著相关性，而2个ABCB1 rs1128503和rs2032582成保护作用，VEGFR2 RS2305948可能与发生手足综合症的风险相关，ABCG2 rs2231142起保护作用，VEGF-A rs2010963可能与黏膜保护相关，然而经过多重检验校正后这些相关性无统计学意义（见表4）。

图1 对比舒尼替尼治疗后的肾癌患者VEGFR3中rs307826和rs307821位点变异型的无进展生存期的Kaplan-Meier曲线分析

3 讨论

本前瞻性研究对SNPs作为评估舒尼替尼作为之前未做任何治疗的透明细胞肾细胞癌的一线治疗药物的疗效和毒性的预测因素进行了研究，该研究显示2个VEGFR3的错义多态性与PFS缩短有显著的相关性，其中CYP3A5的一个功能性多态性与舒尼替尼因不良反应剂量减少的风险增加有关。这些相关性尽管未在独立的机构进行确认，但是多个检验纠正后仍有统计学意义。这些数据表明应该提高针对这些有遗传学变异的肾癌患者的个性化治疗方法。

治疗肾癌可供选择的药物越来越多，包括4个已经批准上市的抗血管生成药物（所拉菲尼、舒尼替尼、贝伐单抗和帕唑帕尼）以及3个其他类别的处于研发后阶段的药物（阿西替尼、tivozanib、多维替尼）以及多种mTOR抑制剂。确定此类药物疗效和不良反应相关的生物学标志物的是推进药物发展和提高患者治疗质量的重要一步，因此，研究目的是确定影响舒尼替尼治疗效果，是否可作为潜在的生物学标志物生物多态性，此多态性主要集中在改变舒尼替尼的药物代谢和药物动力学的遗传学变异体（见表2）。本研究发现VEGFR3和CYP3A5的多态性可以解释在一些患者中使用舒尼替尼无效或低耐受性。

表2 多态性的基因型和等位基因频率

表3 舒尼替尼治疗肾细胞癌患者的有效率，无进展生存期与总生存期与多态性相关的多变量分析

VEGFR3是VEGF的一个跨膜的酪氨酸激酶受体，主要与淋巴管生成相关，尽管该受体的初始表达被局限于成人的淋巴管，但是研究已经确认VEGFR3不仅在肿瘤血管表达，而且认为其还是其他促血管生成因子的重要调节物。临床前模型已经报道，VEGFR3与肿瘤的淋巴和远处转移的进展的相关性高于VEGFR2，进一步说明舒尼替尼可以影响血浆可溶性VEGFR3的浓度，这样的变化与舒尼替尼治疗肾癌的药物疗效有关。本研究发现，2个VEGFR3的错义SNPs rs307826（T494A）和rs307821（R1324L），与肿瘤患者PFS的相关性（见表3）相反，van和他的同仁们的研究并没有显示出rs307826与舒尼替尼的治疗后PFS的显著相关性。然而这个带分歧的结论可能与入选研究的患者差异有关。特别是在van的研究中41％患者在接受舒尼替尼之前是使用过其他治疗药物的，而本研究的患者则不允许使用其他治疗，因为rs307862和rs307821是中等连锁不平衡（webappendix p5），因此判断哪个是原因性SNP有困难，或者2者对舒尼替尼的治疗反应都有作用。rs307826影响中度保守的核苷酸，rs307821影响相对弱保守的核苷酸，因为T494A位于VEGFR3免疫球蛋白的同源结构域的5片段（即D5），而R13241L位于蛋白的C-M末端区域。在2个case中生物信息学工具（例如 SIFT 和Align GVGD）预测氨基酸的变化可影响蛋白的功能。然而D5~D5之间的作用可以解释VEGFR3 的二聚体的稳定性和活化。因为本研究显示了这个SNP与舒尼替尼的治疗反应和PFS之间的显著相关性，因此认为rs307862 是原因性变异体，而rs307821不是，是否VEGFR3变异体能否影响患者的预后还未确定。但是它与药物的总体反应的相关性表明它在药物疗效方面发挥的重要作用。

图2 对比CYP3A5中rs776746位点的变异型来分析舒尼替尼治疗因不良反应减量的时间的Kaplan-Meier曲线

表4 引起舒尼替尼减量和不良反应的基因因素

即使是在多个检验纠正后，因不良反应而减量的风险仍与CYP3A5*1显著相关（见图2和表4），它影响CYP3A5的酶的表达。CYP3A5与 CYP3A4分享底物特异性，CYP3A4是催化舒尼替尼代谢的关节酶，这样CYP3A5*1可能导致舒尼替尼活跃而且作用时间长的代谢物SU12662的产生增加，SU12662可引起不良反应。如果确定的话，CYP3A5*1等位基因的频率主要的民族差异在非洲后裔和亚洲后裔中更常见，而欧洲人相对少。这就可以解释在亚洲人中舒尼替尼毒性发生率更高的原因，很显然，von和其同仁们报道CYP3A5*1与PFS改善的相关性，对于CYP3A5*1携带者的舒尼替尼药物动力学情况有待未来进一步研究阐明。特别的毒性（见表4）与高血压最显著相关的SNPs是 VEGFR2、VEGF-A、ABCB1。rini和他的同仁们确立了高血压是舒尼替尼治疗反应的重要预测因素，这样推断，这三个SNPs可以作为舒尼替尼疗效的代表性标志物。与此一致，它作为高血压的保护者，带有ABCB1 rs1128503的变异T等位基因的患者与不带此基因患者相比OS和PFS差（见表3）。然而由于2个研究中血压的检测方法不一样，所以无法进行直接的对比。

查询资料，仅有一个评估了舒尼替尼不良反应的药理学研究以及一个评估治疗作用的研究已经公开发表，尽管研究结果挺有意义，但因为研究是探索性的，多个检验未作矫正。与本研究不一样的还有，这些研究中允许使用其他药物治疗。资料是回顾性收集整理的，在毒性-效果研究分析中还包括了肾癌患者之外的肿瘤患者。尽管有这些不同，一些相关性的报道还是具有相似性，（例如ABCB1 rs 1128503与 PFS（P=0.089），OS（P=0.055）下降有关。VEGFR2 rs1870377与 OS下降有关（P=0.092）。

本研究还存在一定的局限性，时间和剂量的调整没有在核心的方案中确定，放射学评估的时间是根据每一研究中心自己确定，因为研究和结果的评估是按照当前的临床实际进行的，这样治疗的疗程无法标准化。heng 和他的同仁已经建立把血红蛋白，纠正的钙，性能状态，诊断后时间，中性粒细胞，血小板作为使用抗血管生成药物治疗转移性肾细胞肾癌的临床结果预测因子，然而本研究在这个报告发表前已经开始，所以没有基线中性粒细胞数书籍，这样不能将此模型应用到我们研究的患者人群中。与舒尼替尼治疗结果相关的SNPs 具有相对低的等位基因频率（9％rs307821，8％rs307826，和6％ rs776746），降低了研究效力。最后结果本研究不包括前瞻性和外部的验证，本研究的对象主要是白种人，这些多态性与舒尼替尼药物治疗的相关性需要在其他人种中进行研究和评估。为保证我们资料的同质性，仅有透明细胞肾癌患者入选，并排除使用其他治疗药物的患者，并且研究资料由外部监察员进行审核，

所有这些因素可能是本研究结果具强有说服力的保证，而且在多重检验矫正正偏差后，经统计学分析仍有显著相关性。

本研究结果保证了药代动力学研究更好的理解舒尼替尼治疗后减量的分子生物学机制，有待进一步在独立的系列研究中得到验证，如果本研究上述结论能够确定，未来这些遗传学变异能够为个体化肾癌治疗提供有力的基础。

4 系统性综述

使用关键词肾癌、舒尼替尼，多态性查找了截止2007年8月的pubmed和美国临床肿瘤学数据库确定没有有关SNP与舒尼替尼治疗疗效的相关研究。

搜索pubmed确定了舒尼替尼药代和药动相关的基因，在回顾了SNPs数据库中列出的已知多态性后，选择了感兴趣的基因的变异体。在患者招募期间，一个前瞻性研究有关多态性与药物毒性相关性研究公开发表，1年以后有关PFS和OS的另一研究发表。基于这些报道，我们没有更改之前的起初的SNP的选择，但是我们参考了来自帊唑帕尼药理学研究的初步资料，加入了 IL8 的多态性分析。

5 结论

本研究是第一个前瞻性评估单核苷酸多态性作为之前未接受治疗的进展性肾细胞癌患者接受舒尼替尼为一线药物的药物疗效、不良反应的预测因素，我们注意到VEGFR3的2个错义多态性与PFS 显著相关，并且CYP3A5*1等位基因与因舒尼替尼不良反应而减量的风险增加有相关，如果我们的发现能够在独立的系列研究中得到确认，这些多态性可有助于诊断鉴别这一肾癌亚型，并有益于选择合适的治疗方法。