宫颈癌中Survivin mRNA的表达及其临床价值

湖北省武汉市第五医院妇科

黄 玲 邓梅先 宋 芳 刘敏娟 沈汉斌

恶性肿瘤的发生、发展是一个涉及到多基因的分子水平变化的多阶段过程。近年分子生物研究表明，宫颈癌为多基因、遗传、环境等致癌因素等诱导下综合作用的结果，细胞凋亡在宫颈癌发生发展过程中起重要作用。survivin也称生存素或生存蛋白，是凋亡抑制蛋白家族（IAP）的成员，在体外能够直接抑制细胞凋亡下游效应器caspase的活性，具有强大的抗凋亡作用[1,2]。在此我们运用RTPCR方法对22例宫颈癌及其癌旁组织，以在mRNA水平评价survivin基因表达及其变化，了解其与新辅助化疗疗效之间的相关性，为新辅助化疗寻找有效的预测因子。

1 资料与方法

1.1 病例及分组 宫颈癌组：选取2003～2009年间我院收疗的宫颈癌组织22例，病理诊断均为宫颈癌。年龄29～59岁，平均年龄37.2岁。22例宫颈癌中腺癌4例，鳞癌18例。临床病理分期为：Ⅰb期12例，Ⅱa期8例，Ⅱb期2例。癌旁组织组：标本取自上述22例病例距肿瘤2cm以远的组织，经病理检查均无癌。所有样品取出后均冻存于-70℃待检。

1.2 化疗方案 所有患者接受PVB或PF方案的新辅助化疗方案，10天为1个周期，共进行2个疗程。在接受新辅助化疗前接受临床触诊估测及超声检测，每周期化疗结束后重新测量肿瘤大小，全部化疗结束后再检测。肿瘤对化疗的临床评价根据WHO标准[3]，肿瘤对化疗反应的组织学评价根据Ogston的分级方法[4]。

1.3 Survivin mRNA检测 Trizol试剂购自Gibco公司。MMLV逆转录酶、RNA抑制物为Promega公司产品。DNA聚合酶购自日本Takara公司。兔抗人survivin多克隆抗体为Santa Cruz公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自北京中山生物工程公司。

取冻存组织50～100mg，加入1ml Trizol（Gibco公司）充分匀浆，按照二步法提取组织中的总RNA。取少量样本测定RNA的浓度（计算浓度公式为：样品的A260值×40×稀释倍数，单位是μg/ml）和纯度（样品的A260/A280比值），紫外分光光度仪A260nm/A280nm读数在1.8～2.0之间方继续试验。

应用20μl反应体系，每管中加入模板RNA1μg，oligo（dT）50pmol，5×PCR反应缓冲液4μl，dNTP混合物（10mmol/L）2μl，R Nase Inhibitor20U，MMLV反转录酶10U，加DEPC处理的水至20μl。混合后2500r/min离心2min，室温放置10min后转入42℃反应1h，99℃5min灭活反转录酶活性，冰水中冷却2min，完成cDNA合成。人类survivin的PCR引物为5′-CTCAAGGACCACCGCATCTC-3′和5′-CCTCAATCCATGGCAGCCAG-3′，合成产物为392bp，合成产物247 bpβ-actin作为内参照。所有引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件分析。根据数据性质采用χ2检验。P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 Ssurvivin mRNA表达 宫颈癌组标本中Survivin mRNA阳性率为77.3％（17/22），而癌旁组织组表达阴性。而β-actin在宫颈癌组织和对照的癌旁组织中的表达强度基本一致（见图1）。

2.2 新辅助化疗的效果 22例患者经过新辅助化疗后，有1例获得临床完全缓解（cCR），占4.5％（1/22）；12例获得临床部分缓解（PR），占54.5％（12/22）；9例获得临床稳定（SD），占40.9％（9/22），无1例发生疾病进展（PD）。

2.3 Ssurvivin mRNA在宫颈癌患者各特征性因素中的表达 Survivin mRNA表达阳性在37.2岁以下为10/12（83.3％），37.2岁以上为7/10（70.0％）；病理分型：腺癌为4/4（100.0％），鳞癌为13/18（72.2％）；肿瘤分期：Ⅰb为9/12（75.0％），Ⅱa期为6/8（75.0％），Ⅱb期为2/2（100.0％）；Survivin mRNA的表达与患者的年龄、病理分型、分期均无关（P＞0.05）；Survivin mRNA表达阳性在新辅助化疗后完全缓解（cCR）的患者中为0/1（0.0％）、获得临床部分缓解（PR）的患者为8/12（66.7％）和获得临床稳定（SD）的患者为9/9（100.0％），差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是发病率和病死率仅次于乳腺癌的最常见的女性恶性肿瘤。近40年来随着宫颈癌筛查的普及开展，其发病率及病死率已明显下降，但有年轻化趋势，关于这种趋势的原因和特点已引起国内外的广泛关注[5]。宫颈癌细胞的侵袭和转移是一个复杂过程，涉及到血管、淋巴管新生、细胞外基质降解和细胞凋亡调控等很多因素。

注：L1为宫颈癌扩增电泳结果（392bp）；L2为宫颈癌旁组织电泳结果

近年研究发现，凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）家族在细胞凋亡的基因调控中发挥重要作用[6]，凋亡不仅在正常生理调节中起关键作用，在恶性病变过程中也起着重要作用。细胞凋亡过程受凋亡抑制基因与凋亡活化基因的共同调节[7,8]。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，是IAP家族中最小的成员，它由定位在人染色体17q25位点的单拷贝基因编码，是含有142个氨基酸、相对分子质量为16 500的蛋白，具有抑制凋亡和调节细胞分裂的作用[7]。survivin其结构独特，仅含有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列（BIR）分子，作用于各种凋亡通路末端效应分子，是迄今发现最强的凋亡抑制因子之一。实验研究证实[9]，survivin能抑制Fas、caspase、bax及某些化疗药物诱导的细胞凋亡。survivin的组织分布特征具有明显的细胞选择性，在正常成人组织中几乎未检测到survivin基因的表达[10]。而在大多数肿瘤组织内有survivin的表达，这种重新表达的机制目前尚不明确[11]。survivin具有周期依赖性表达及抗凋亡作用。

Kim等[12]采用免疫组化方法检测了4l例宫颈内皮瘤和宫颈鳞状细胞癌，结果显示survivin在低度鳞状上皮内瘤样病变、高度鳞状上皮内瘤样病变及SCC中的阳性表达率分别是66.7％、87.5％和100％，差异有统计学意义（P＜0.01），表明sruvivi阳性表达与宫颈肿瘤的进展密切相关。本研究对宫颈癌组织Survivin mRNA表达测定发现，宫颈癌细胞高表达Survivin mRNA，本组阳性率为77.3％。肿瘤细胞Survivin mRNA表达水平较正常宫颈组织明显增高，表明其与宫颈癌发生发展密切相关，可能是参与抑制恶性瘤细胞的凋亡过程中的关键因素。Survivin mRNA表达与临床特征相关性的分析显示，肿瘤内Survivin mRNA的表达与宿主年龄、病理分型、分期均无关。

研究显示，survivin与宫颈癌的形成和发展有着密切的关系[13]，其过度表达可克服凋亡的关卡，通过有丝分裂促进转化细胞的异常增殖；survivin的过表达可能与化疗药物的耐药性相关[14]。本研究结果显示，宫颈癌化疗Survivin mRNA的表达水平与新辅助化疗疗效存在相关性，即新辅助化疗后获得临床稳定（SD）的患者、获得临床部分缓解（PR）和完全缓解（cCR）的患者相比，后者的化疗疗效好于前者。本研究结果显示了Survivin mRNA的表达阳性的化疗疗效效果差也可能与顺铂耐药相关。

通过对宫颈鳞癌组织及癌旁组织中Survivin mRNA表达的研究，提示宫颈癌的发生、发展与细胞凋亡调节异常及细胞增殖活性增加有关。Survivin mRNA的异常表达与宫颈癌的发生、发展相关，可以作为宫颈癌新辅助化疗疗效的手段之一。Survivin mRNA在宫颈癌组织中的异常表达，导致细胞凋亡减少，对宫颈癌的发生起到重要作用，可为临床筛查宫颈癌及判断预后提供新的依据和诊断指标。

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