抗体药物研发概况

沈倍奋

（军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850）

抗体药物以其与靶抗原结合的高特异性、有效性和安全性，在临床恶性肿瘤、自身免疫病等重大疾病的治疗中取得突破，发展迅速，是当前生物药中复合增长率最高的一类药物，成为生物制药产业的领头羊。至今，美国FDA批准了34个抗体药物和6个Fc融合蛋白。2010年销售前10位的生物药中单抗有7个，分别是Enbrel、贝伐单抗（bevacizumab，Avastin）、利妥昔单抗（rituximab，Rituxan）、阿达木单抗（adalimumab，Humira）、英 利 昔 单 抗 （infliximab，Remicade）、曲妥珠单抗（trastuzumab，Herceptin）和Lucentis。由于单抗药物具有巨大的经济效益和社会效益，是目前生物制药产业中最重要的研究领域，也是各国争相竞争的焦点。

抗体药物的发展经历了鼠源性抗体、人源化抗体和全人抗体三个阶段。人源化及全人抗体近年来发展迅速，在FDA批准的抗体药物中已占80%以上，人源化及全人抗体以其低排斥反应等优点成为抗体药物发展的主要趋势。

抗体虽然是一个天然分子，但作为治疗用药物必须满足生物制剂的各项要求，如：亲和力、Koff、特异性、稳定性、溶解度、聚合度、表达水平和功能等。因此，得到一个抗体基因，并不是表达后就能成为药物，必须要对其进行改造，使其符合上述要求。我国抗体药物产业化的瓶颈主要在两个方面，上游的瓶颈是：在获得人源化或人源抗体后的抗体亲和力提高、效应功能提高、抗体表达量提高。中下游的瓶颈是：在什么样的培养条件下保持细胞活力、抗体分泌量和高密度生长。要解决这两方面的问题需要多种技术的整合，也需要上、中、下游的紧密合作才能实现。目前在这两方面的主要进展如下。

1 抗体人源化改造

最早出现的人源化抗体是人－鼠嵌合抗体，由鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基因上获得。一般嵌合抗体的人源化程度可达70%，大大降低了鼠抗体的免疫原性，而保持了亲本抗体的特异性和亲和力，例如美国FDA批准的ReoPro、Rituxan、Remicade、Simulect、Synagis和Erbitux等。嵌合抗体在临床应用中已被证明是安全的，但不能完全消除人抗鼠反应（HAMA）。

进一步人源化的方法很多，最早是CDR移植，将鼠抗体的CDR移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上。简单的CDR移植往往会明显降低抗体的亲和力，甚至丧失与抗原结合的能力；在CDR移植的同时，将一些支撑CDR loop构象的鼠Ig框架区氨基酸也进行移植，可有效保持亲本鼠抗体的亲和力和特异性。另一种常用的人源化方法是表面重塑技术，即鼠抗体框架区表面氨基酸的“人源化”，具体是通过鼠和人抗体可变区立体构象叠合比对，寻找合适的人抗体模板，将鼠Fv段表面暴露的框架区残基中与人Fv不同的改为人源的氨基酸，达到鼠Fv的表面残基人源化，降低免疫原性；由于该方法不影响Fv的整体空间构象，所以获得的抗体仍保留与抗原的结合能力。

Dallacgua WF提出框架改组（framework shuffling）的方法进行抗体人源化改造，主要是将鼠抗体的6个CDR区以正确的读框融合到人Ig胚系框架中，构建成库，用相应抗原筛库，由于筛出的抗体框架来源于相匹配的CDR序列和结构，因此它保留了与抗原的最好结合，这种抗体接近于天然的全人抗体。如果抗原有晶体结构，则可以采用特异性决定基（specificity determining residues，SDR）移植的方法，该方法首先需要分析待改造抗体的结合位点，或通过抗原－抗体复合物的三维结构确定抗体高变区中与抗原结合的关键氨基酸，然后将这些决定特异性的关键氨基酸移植到相匹配的人抗体相应位置上。

去免疫原性是一项专门的平台技术，包括确定和去除鼠抗体上能被人T细胞识别的表位，这样的治疗性抗体不再激活T细胞反应和以后的HAMA反应，如Biovation技术。迄今为止，经不同人源化方法改造的上市抗体有：Zenapax、Herceptin、Mylotarg、Campath、Xolair、Raptiva、Avastin、Tysabri、Actemra等。

2 人源抗体制备技术

目前人源抗体制备技术包括：人－人杂交瘤技术、EB病毒转化人B淋巴细胞、抗体库技术和转基因鼠技术，最常用的是抗体库技术和转基因鼠技术。

20世纪90年代，抗体库技术的出现为抗体人源化和人源抗体的制备开辟了新途径。该技术在体外模拟了抗体的体内成熟过程，从B淋巴细胞中扩增全套抗体的轻链和重链基因，克隆到特定载体上，使抗体展示于噬菌体表面，构成噬菌体抗体库（Phage Antibody Library），库容一般在107左右；用抗原筛选出表达相应抗体的噬菌体，经扩增、测序可获得特异性抗体基因。如果B细胞来源于人外周血，则可得到全人抗体。噬菌体表面展示技术的优点是可以直接得到人源抗体，不需要经过免疫系统和免疫步骤，避免了鼠抗体的人源化改造过程，但得到的抗体往往亲和力较低，需要在体外对抗体的亲和力和特异性进行改造。用该方法获得的上市抗体有Humira、Vectibix等。

抗体库的质量（多样性和亲和力）与抗体库的库容量成正比。为了获得高亲和力的抗体，往往需要大容量抗体库。因此，人们在噬菌体抗体库的基础上，引入Cre－loxP体内重组系统，一个细菌同时被多个噬菌体感染后发生重组，通过这种方式，可以得到库容大于1011的抗体库。

抗体基因除了展示在噬菌体表面，也可以展示在酵母、细菌表面和核糖体上。特别是核糖体展示技术，由于噬菌体抗体库需要通过生物体转化，受转化效率的影响，一般库容不大。近年来利用RNA技术进行的抗体基因核糖体展示不需要通过生物体转化的过程，它完全在体外无细胞体系中进行，不涉及活细胞、载体、噬菌体，从而避免了文库导入细胞所必需的转化步骤带来的转化效率的限制。因此，它有2个突出优点：①抗体文库的多样性不受细菌转化效率的限制，有可能达到1014这样大的库容；②核糖体展示技术的方案中有许多PCR扩增步骤，易发生突变，因此，很容易引入进化机制。

构建抗体库涉及到的一个重要因素，就是抗体基因的来源。抗体库的抗体基因，既可来源于人或动物的外周血淋巴细胞、骨髓、脾细胞等生物体，也可以是通过基因合成获得（合成抗体库）；同时，也可以在一个抗体库中，既有生物来源的抗体基因，又含有合成的抗体基因（半合成抗体库）。由于人抗体基因的保守性，德国Morphosys公司对人类抗体胚系基因及所有重排序列进行分组，其中95%以上序列可归为14个亚组：7个重链VH亚组（VH1A，VH1B，VH2，VH3，VH4，VH5，VH6），4个 Vκ亚组（Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4）和3个 Vλ亚组（Vλ1，Vλ2，Vλ3），亚组中的每个成员之间都有高度的同源性。因此，可以设计合成14个亚组各自通用的基因，作为构建组合抗体库（combinatorial antibody library）的主干基因，由此组合而成的抗体库称合成抗体库。与生物来源的抗体库相比，合成抗体库的优点在于库的内容、位点变异性及库的整体多样性均可操作和控制。在合成过程中可以在各种元件两侧引入合适的限制性内切酶位点，便于进行基因操作，如：将轻、重链的CDR区设计成两侧带有酶切位点的盒式结构，便于替换。也可以引入大肠杆菌偏性密码，使其在大肠杆菌中高效表达。由于载体和抗体基因的模式设计及模块性操作使得单链抗体（scFv）能够通过简单的克隆步骤，快速切换成不同的微抗体形式，如二硫键联接Fv片段、Fabs、免疫毒素或多价结构的抗体。

抗体库都需要经过筛选才能获得我们需要的特异性抗体。常规筛选抗体库的方法是用一个抗原通过类似亲和层析的方法，从抗体库中将与之结合的抗体“钓”出来，由此衍生出多种抗体库的筛选方法。但从抗体库中获得的抗体往往亲和力不高，需要进行亲和力成熟的改造。

抗原表位定向选择（epitope guided selection）是利用抗体库技术进行鼠抗体人源化的又一种方法。将鼠抗体的轻链或重链文库，与人抗体的重链或轻链文库配对构建成“人－鼠杂合抗体库”，筛选与抗原结合的克隆，分离获得人抗体的重链或轻链基因，再将它们与人的轻链或重链文库混合，用抗原筛选，就能得到与抗原结合的特异性人抗体。

另一个制备人源抗体的有效方法是利用转基因鼠，该鼠敲除了鼠源免疫球蛋白基因组，而转入人免疫球蛋白基因组。这种小鼠的B细胞在分化成熟的过程中，以及成熟的B细胞在针对某个抗原进行抗体反应时，所使用的抗体基因是转入的人源抗体的基因。因此，用抗原免疫后可产生高滴度的人抗体。转基因鼠技术解决了抗体库技术中抗体亲和力不高的问题。

随着结构生物学、计算生物学、生物信息学、计算机科学的迅速发展，借助已有的抗原／抗体序列、结构信息以及抗原—抗体相互作用模式分析，合理确定功能抗体识别的靶位（即抗体药物的靶点），并进而应用计算机辅助分子设计理论、高通量虚拟筛选技术开展抗体模拟物（包括高亲和力人源抗体）的从头设计成为研究的热点。

目前，基于抗原－抗体的作用复合物结构开展抗体模拟物的从头设计研究尚处于起步阶段，设计的成功与否与靶抗原的结构、抗原－抗体复合物结构以及药效团构象有着密切的联系。然而，由于该方法回避了杂交瘤技术、抗体人源化技术、抗体库技术等，必将有着广泛的应用前景。

3 提高抗体亲和力

经过抗原多次刺激，B细胞克隆产生的抗体亲和力越来越高。然而体内亲和力成熟往往仍达不到抗体靶向治疗的要求，因此，需要在体外进行抗体亲和力成熟。现在已有很多方法可模拟体内抗体亲和力成熟的方式，在体外进行抗体亲和力成熟。

3.1 CDR区突变

CDR区突变是一种模拟体内体细胞突变的方法，它包括定向诱导突变和随机诱导突变，前者需要对抗原－抗体相互作用的立体结构有很好了解的情况下采用，否则成功率不高，而随机突变通过引进随机的碱基替换，进而筛选理想的突变体。易错PCR技术是一种引入突变的简便方法。

3.2 链替换（chain shuffling）

根据抗体可变区随机配对的原理，将抗体的一条链保持不变，替换另一条链，然后用抗原进行筛选，重复进行链替换和亲和力筛选，将产生高亲和力的抗体。

3.3 分子展示（molecular display）技术

包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示和mRNA展示等。它们各具特点，都可以用于抗体等蛋白质的亲和力提高，其基本原理是将抗体基因编码的抗体蛋白展示出来，通过抗原选择，获得亲和力提高的抗体。

3.4 基于计算机设计提高抗体亲和力

目前，基于计算机辅助设计提高抗体亲和力的方法主要从构象、能量两个方面考虑。基于计算机辅助设计提高抗体亲和力的方法减少了实验的盲目性，然而，设计的成功与否要依赖于抗原－抗体相互作用动态模式、界面构象特征的合理判定，因此，在抗原或抗原－抗体作用复合物晶体结构已知的情况下成功率较高。

4 提高抗体效应功能

治疗性抗体的作用机制有多种，主要可归为2个基本类型：一类是依赖于它们的抗原结合功能，例如抗体与抗原结合后阻断或中和靶分子的生物学活性、利用抗体的靶向性，将细胞毒性物质导向到靶部位、抗体与细胞膜抗原结合后诱发信号传导的改变，引起细胞凋亡等；另一类除与它们的抗原结合能力有关外，还与抗体的Fc结构有关，如激发ADCC和CDC效应，因此改进抗体与FcγRs或补体的结合，可以提高它们的治疗效果。根据上述作用机制，可针对性地对治疗性抗体进行改造，提高其效应功能。

4.1 以抗体为导向载体的免疫结合物（Immunocojugate）

免疫结合物是以抗体或抗体片段为载体连接放射性核素、药物或毒素构成。这些细胞毒性物质大大增强了抗体杀伤靶细胞的能力。2011年美国FDA批准的Brentuximab vedotin（Adcetris）就是抗体与monomethyl auristatin E的化学偶联物。

4.2 免疫细胞因子（immunocytokines）

抗体与细胞因子基因连接后表达的融合蛋白称免疫细胞因子，它可将抗体的特异性与细胞因子的有效免疫刺激活性有机结合起来。

4.3 双特异性抗体

双特异性抗体亦称双功能抗体，是同一抗体的2个抗原结合部位分别针对2个不同的抗原。因此，可以同时与2种抗原发生反应，并使之交联，因此双特异性抗体可介导标记物或效应分子与靶抗原的结合，更好地行使效应分子的功能。

4.4 改造抗体的Fc增加ADCC和CDC效应

抗肿瘤的治疗性抗体的疗效直接与抗体的ADCC和CDC效应有关，前者是抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，后者是补体依赖的细胞毒作用。上市抗体中Rituxan、Herceptin、Remicade等都有ADCC效应，Rituxan和Campath－1有CDC效应。当抗体的Fc与NK细胞上的FcγRIIIa结合就激发ADCC效应，改造抗体Fc使之提高与FcγR亲和力是改进治疗效果的方法之一。影响Fc与FcγR结合能力的因素有2个，一是FcγR上的氨基酸序列，另一个因素是Fc的糖结构模式（glycoform），人IgG1－Fc连接的寡糖是双触角复合型的，具有一个核心结构，核心结构中有岩藻糖的抗体其ADCC效应差，没有岩藻糖的抗体其ADCC效应明显提高，岩藻糖的存在与否不影响抗体与抗原结合及CDC效应。晶体结构分析表明：人IgG1抗体Fc连接的寡糖是整合到Fc区域，并通过多个与CH2的非共价相互作用影响Fc构型。因此，提高ADCC的策略是：①在抗体的Fc上经合理设计进行氨基酸突变，表达出抗体后，进行功能比较，选择ADCC效应高的突变体；②去除抗体Fc连接的寡糖上的岩藻糖。减少岩藻糖的方法有2种：一种是细胞培养过程中进行培养基和培养条件优化，改变糖基化途径，达到抗体低岩藻糖化；另一种是将宿主细胞中的岩藻糖基转移酶基因（如：FUT8基因）敲除。

抗体治疗中的CDC效应主要是抗体恒定区与补体C1q结合启动的，提高CDC效应的策略是：①突变恒定区的氨基酸，增强其与C1q的结合能力，提高CDC效应，②将人IgG1和IgG3重链恒定区序列进行DNA改组（DNA shuffling），筛选出CDC活性高的组合。

提高抗体效应功能的方法有很多，在进行抗体改造的时候，应该有目的性地选择单一的方法进行；盲目地将多种提高效应功能的方法用于同一个抗体，则很难预测它们引起的构型变化和生物活性变化。

5 抗体表达系统

目前完整抗体分子的表达需要用真核系统，如：酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞系统。前三种系统由于其糖基化方式和类型与人类不同，一般用于临床的治疗性抗体不采用；而哺乳动物细胞表达系统能正确组装成多亚基蛋白，表达的抗体与天然抗体的结构、糖基化类型和方式几乎相同；经过驯化的哺乳动物细胞能以悬浮培养方式，在无血清培养基中高密度、大规模培养。与原核系统相比，哺乳动物细胞表达系统的缺点是表达量低、生产成本高。为了提高表达量，多年来人们从表达载体、宿主细胞和培养工艺等多方面进行研究。用于治疗性抗体表达的细胞系主要有SP2／0、NS0和CHO细胞。外源基因在真核系统中的表达受很多因素影响，如：整合目的基因的染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰的效率等。其中外源基因在基因组上整合的位置效应尤为重要，它直接影响基因表达。因此，提高抗体基因在哺乳动物细胞中的表达，除了考虑启动子、增强子、转录终止信号、多聚腺苷酸加尾信号等对转录水平高低及mRNA稳定性的影响及优化表达基因的密码子外，还要重点关注位置效应对基因表达的影响。

6 规模化细胞培养的进展

目前有几百个抗体药物正在开发，除了抗体片段外，都用哺乳动物细胞培养系统，但抗体药物的用量是其它生物药的10～100倍，每年需要约3000～6000Kg。由于中下游的技术进展涉及制药公司的机密，很少能得到公开资料。从大的方面看，以下几方面值得关注：

6.1 优化细胞培养

通过了解各种因素对细胞行为的影响，优化培养基、培养条件，提高产量和质量。

6.2 细胞系改造

对于细胞系的改造日趋关注，主要集中在降低细胞凋亡、改善细胞活性，提高生长密度和产物表达量。

6.3 分析技术发展

过程分析技术的发展，实现实时过程分析和控制，细胞系的分析和筛选，糖基化和糖型的分析，以保证抗体药物的质量。

近几年抗体药物开发的新动向：①针对新抗原（靶分子）的抑制剂或激动剂，如 C5、IL－1β、IL－6R、TPO、IL12／23p40、EpCAMxCD3等；②出现第二代抗CD20和IL－1β抗体，第四代、第五代抗TNFα抗体或抗体衍生物；③抗体的新适应症，包括罕见疾病，如：治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）、冷吡啉相关的周期性综合征（CAPS）、免疫性血小板减少性紫癜（ITP）；④新的抗体形式，包括基因工程改造的Ig衍生物，如：IgG2／4、Fab－PEG、peptide－Fc、双特异性／三特异性抗体、无海藻糖抗体等；⑤在印度、韩国批准了第一代Biosimilar产品。