胰岛分离纯化方法概述

高 茜，任曙光，吴建华，巨英超，王 原＊

（1.河北医科大学第四医院内分泌科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第四医院实验动物中心，河北石家庄 050011）

胰岛是胰腺的内分泌部分，是在胰脏腺泡之间散在的细胞团。胰岛细胞按其染色和形态学特点，主要分为A细胞、B细胞、D细胞及PP细胞。B细胞占胰岛细胞的60%～70%，分泌胰岛素（insulin）。胰岛B细胞可根据血糖浓度调节胰岛素释放量，维持血糖浓度稳定。1型糖尿病为胰岛B细胞功能受损引起的胰岛素分泌绝对或相对不足，需长期注射胰岛素维持生命，胰岛移植创伤小，并可消除常规治疗产生的低血糖症状，是治疗1型糖尿病最有前景的方案［1－2］。2型糖尿病的特点为胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足。疾病早期为胰岛素抵抗，胰岛素代偿性分泌增加以保持正常糖耐量，经过漫长的病理过程，血中胰岛素效力减弱、胰岛素代偿性分泌减少，经过体内反馈系统的启动，首先累及胰岛，使之长期超负荷工作失去代偿能力。为此，针对胰岛的研究显得尤为重要，分离纯化高纯度、有活性、有功能的胰岛不仅是体内、外胰岛移植的基础，而且可以直接作为体外功能检测的指标。胰岛的获得需经过胰腺消化、分离纯化，然后进行产量和活性鉴定、体外功能检测，本文对胰岛分离纯化过程的各种方法进行了综述，探讨如何提高分离纯化后胰岛的产量及质量，可用于今后胰岛的相关后续研究。

1 胰岛的分离

胰岛分离是采用特异的消化酶消化胰腺获取胰岛细胞的过程。胶原酶可以高效消化胰岛周围结缔组织和其他胰腺组织，是胰岛分离应用最广泛的试剂。胶原酶是一种从梭形杆菌中提炼出的蛋白酶，包括胶原酶、梭形菌酶、胰蛋白酶及分散酶，它通过分解原蛋白和其他蛋白，可以更好的分离胰岛和其他组织［3］。

目前胰岛的分离主要采用以下几种方法。

1.1 切碎法

标准化组织切碎消化法（切碎法standard chopped tissue digestion process）是 Moskalevski S于1965年首创的，之后被Lacy P E和 Kostianovsky M改良［4］。首先体外分离胰腺组织，切成碎片，置于胶原酶液中37℃消化。此种方法虽然操作简单，然而胶原酶溶液很难到达组织块的内部，会造成组织内外消化速度不一致，导致胰岛的活力较差，且极易损伤胰岛［5］。

1.2 胆总管穿刺法

Gotoh M等［6］建立的胆总管内胶原酶灌注技术无需切碎胰腺，直接穿刺胆管并置管，注入胶原酶液，使之膨胀，再钝性分离，37℃水浴消化。此种方法能充分扩张胰腺，消化间质组织，提高了分离效果，所得产量明显高于切碎法，并以静态消化的形式减少了机械消化对胰岛的损伤。目前，逆行胰管注射胶原酶的方法，已被广泛应用于胰岛分离的研究，且被不断更新改进［7］。由于小鼠的胆总管非常细小，应用此方法分离小鼠胰岛对置管技术要求较高，穿刺针需用超细的软管，而且禁忌反复穿刺，Li D S等［8］提出于肝总管与胆囊管交叉处穿刺更加简便易行。

1.3 胆囊穿刺灌注

近些年有学者［9－10］在胆总管穿刺术基础上提出胆囊穿刺灌注的方法。于胆囊顶部穿刺，排出胆囊和胆总管内胆汁，结扎胆囊中部及胆总管入十二指肠处，使消化液缓慢注入胰腺内。祁小平等［9］在消化液和分离液中加入了大豆胰酶抑制剂和牛血清白蛋白组分V，使胰岛产量、活性明显提高。后有学者认为小鼠胆道系统变异多，有时胆囊管开口较低，夹闭胆总管的同时可能夹闭胆囊管开口，导致胶原酶液无法逆行至胰腺，另外小鼠胆囊颈较为狭窄弯曲，灌注时无法达到有效的压力，胰腺充盈并不理想［11］。

1.4 多点穿刺注射法

李明、蔡德鸿等人［5］同时摘取多只小鼠的胰腺，对胰头、胰体、胰尾多部位反复注射胶原酶－P溶液，37℃水浴消化。此方法简便、成功率高，避免了传统切碎法消化不均匀，接近了胆总管内灌注的效果，且几只胰腺同时消化，避免了单只消化移植供源不足的问题。

2 胰岛的纯化

胰腺组织经水浴消化后，胰岛与间质组织混杂在一起，需将胰岛与间质组织分离，才能得到纯化的胰岛，用于研究和移植。主要的方法有以下几种。

2.1 Ficoll密度梯度离心法

目前，设置密度梯度离心的方法被广泛应用于胰岛的纯化。Ficoll400是一种水溶性聚蔗糖，可形成等渗的密度梯度，将胰岛组织与最高密度梯度液混匀，依次加入3种密度梯度递减的溶液，离心后胰岛大部分存在于第一、二层界面。此方法所得胰岛产量及纯度较高，已被广泛应用并不断改进［12］。袁宇等［13］对Ficoll液的比重和加入顺序做了调整，阻止体积较大的胰岛继续下沉，使胰岛从外分泌腺组织中分离出来，改进后的方法提高了胰岛的产量，增加了胰岛的纯度和成活率。各项研究均显示间断密度梯度离心的方法获得胰岛的纯度较高，但梯度液配制过程繁琐，反复吸管加样有污染的可能。徐艳艳等［14］在研究大鼠胰岛分离纯化技术时比较了Ficoll400和Ficoll－PaquePLUS两种离心液的纯化效果，结果显示Ficoll－PaquePLUS离心液纯化的胰岛纯度更高，而且操作更加简便。

2.2 Histopaque纯化法

张梅等［15］将终止消化后的胰岛重悬于5mL Histopaque溶液，再加入5mL Hanks液，离心后吸取两层之间的胰岛。此方法操作简便，获得的胰岛纯度较低，需通过显微镜下手检，胰岛纯度才可达100%。

2.3 单一密度梯度离心法

近些年，李明等［5］应用自制的推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化胰岛获得了一定的认可。该法使用自制的20mL推进式离心管抽取密度梯度液10mL（25%Ficoll－400 1.088g／mL），将5mL细胞悬液泵入到梯度液之上，离心后保留第一层下1／3及第二层的上1／3段，使用RMPI－1640液离心洗涤2次，混于Hanks液。此方法通过离心管内的活塞装置进行加样和出样，将消化物加载于连续密度梯度液之上，离心后胰岛大部分在分界面上下连续分布，减少了反复吸管加样带来的污染。

2.4 过滤法

Kopska T等［16］利用胰岛细胞可以悬浮于培养液表面的特性，反复过滤、培养，使胰岛细胞团和胰腺外分泌组织分开，形成单层培养。此种方法简便易行、节省时间、价格便宜，不仅可以获得高产量、有功能的胰岛，而且避免了使用梯度液过程中污染的可能。

2.5 碘克沙醇纯化法

碘克沙醇分离液是一种新型无内毒素的等渗密度梯度液，可提高胰岛恢复率、减少纯化过程对胰岛的损伤，Noguchi H 等［17］采用1.085、1.090、1.095、1.100、1.105g／mL的碘克沙醇密度梯度纯化人胰岛，胰岛产率和复苏率都显著提高。于湄等［18］比较了Ficoll、淋巴细胞分离液、及碘克沙醇对大鼠胰岛纯化后的产量、纯度、活性、形态以及体外功能进行评估，发现经淋巴细胞分离液及碘克沙醇纯化的胰岛纯度和存活率均显著增加，淋巴细胞分离液与碘克沙醇对胰岛纯度和存活率无明显差异。

3 胰岛的产量及活性鉴定

胰岛的产量及活性是鉴定胰岛分离纯化效果的重要指标。

3.1 特异性染色

胰岛β细胞含锌，双硫腙（DTZ）可与锌螯合而将胰岛特异性染成猩红色，非胰岛β细胞不着色［19］。

3.2 胰岛计数

用移液器在胰岛悬液中取样50μL，重复取样3次，分别镜检计数DTZ阳性细胞团数，按以下公式计数胰岛：胰岛数＝（3次阳性总数／3）×20×样本量（mL），将1个直径为150μm的胰岛团块称为1个胰岛当量（IEQ）［1，20］。

3.3 胰岛活性鉴定

细胞排除法或DNA结合染色被用来区分活细胞和死细胞，二乙酸荧光素（FDA）可以进入正常细胞将其染成蓝色，而碘化丙啶（PI）可穿过凋亡或即将死亡细胞的膜染成红色，FDA／PI表示胰岛生存能力［21］。吖啶橙荧光素（AO）／碘丙啶（PI）荧光染色时，AO可透过正常细胞膜显示绿色，死细胞染成红色，胰岛细胞成活率用胰岛活细胞占所有胰岛活细胞和死细胞总数百分比表示［22］。

4 胰岛素体外释放试验

胰岛通过分泌胰岛素调节血糖水平，胰岛素释放试验可用来鉴定胰岛的功能［23］。过夜培养有利于胰岛从损伤中修复。胰岛在葡萄糖刺激下可释放胰岛素，手工挑选胰岛，置于高浓度、低浓度葡萄糖中培养，测定胰岛素浓度，葡萄糖刺激指数（stimulation index，SI）＝高糖时胰岛素浓度／低糖时胰岛素浓度，用来反映胰岛功能。健康胰岛SI为2～20［7］。合适的培养条件对胰岛功能发挥至关重要，经11 mmol／L葡萄糖培养胰岛细胞凋亡率最低，低于此浓度的葡萄糖会减少胰岛素分泌，而浓度过高则会带来显著毒性反应，引起细胞凋亡，有研究显示此种毒害性具有Ca2＋依赖性，而三羧酸可以抑制此种毒害作用［24－25］。Groot M 等［26］研 究 大 鼠 胰 岛 产 量 和功能具有供体依赖性时发现加入了3－异丁基－1－甲基黄嘌呤（IBMX）的培养基较单纯葡萄糖刺激产生的胰岛素水平高出1／5，该试验证明IBMX可引起高效胰岛素分泌反应，且与供体依赖性无关。

5 影响因素

胰岛分离纯化是个极其复杂的过程，微小的环节也会影响试验结果，其中以胰腺消化最为重要。若消化时间过短则消化不足，胰岛与外分泌腺泡脱离不彻底，在纯化过程中会因胰岛密度改变而导致获得率下降；若消化时间过长则消化过度，胶原酶对胰岛结构功能会造成损伤。在温度37℃、胶原酶溶液pH 7.8、［Ca2＋］7.5mmol／L，加入10mmol／L羟乙基 哌 嗪 乙 硫 磺 酸 （4－（2－hydroxyethyl）－1－piperazineethanesulfonic acid，HEPES）保持pH 相对稳定，胶原酶－P浓度为1.0mg／mL的条件下，消化25 min能获得最高的胰岛产量［22］。有研究比较了几种不同浓度的胶原酶V对大鼠胰岛分离纯化产量的影响，结果显示胶原酶浓度在1.0mg／mL～1.2 mg／mL的情况下，胰腺消化时间一般在15min左右，另外，胶原酶的其他参数对胰岛的产量和质量也会产生不同的影响，包括生产公司、生产批号、生产工艺等，而且同一厂家不同批次的胶原酶也会对结果产生一定的影响［27］。另有研究显示［28］，胰岛在整个分离和培养过程中都无有效的氧供，由此可引起细胞的死亡或凋亡，在整个分离纯化过程中加入三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）可以抑制胰岛细胞凋亡，对胰岛功能的损害起到了抑制效果，从而对胰岛的活力具有保护作用。

6 小结

胰岛的分离纯化是胰岛移植的基础，也是胰岛体外功能检测的前提。关于各种药物对糖尿病治疗效果的研究越来越多，而评价药物治疗效果的一项重要因素就是对于胰岛功能的检测，因此获得高质量高产量的胰岛极其重要。虽然关于胰岛的分离纯化的研究已经日渐深入，研究技术得到不断改进，分离纯化方法已趋向完善，然而胰岛的产量和质量仍不十分令人满意，很多试验中的细节需要被重视起来。虽然目前的试验研究仍未解决分离纯化过程的所有问题，但胰岛制备的前景仍是相当可观，例如，非胶原酶试剂的探究，分离后周围环境对胰岛细胞的生存及功能修复作用及低成本分离液的出现等。相信随着科研技术的飞速发展，胰岛分离纯化过程的高效性、一致性会进一步提高。

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