动物性产品中三聚氰胺的危害及检测方法研究进展

陈敏艳，刘 伟，郭抗抗＊，宁蓬勃

（1.陕西省兽药监测所，陕西西安 710016；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

三聚氰胺（melamine）又名2，4，6－三氨基－1，3，5－三嗪、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，主要用于合成三聚氰胺甲醛树脂（melamine－formaldehyde），其作为工业原料还普遍存在于塑料、涂料等材料中。除此之外，三聚氰胺被添加于动物饲料中作为氮补充剂使用，同时也作为农药杀虫剂如环丙三氨三嗪的代谢产物在实验动物体内发现［1］。目前国际上通用的测定饲料和食品中粗蛋白质的含量的方法凯氏定氮法，其原理是以测定出的含氮量多少乘以6.25得出蛋白质含量。三聚氰胺（含氮量66.67% ）添加到动物饲料或食品中能提高了虚拟蛋白质的含量而被一些不法商贩所利用，其在食品或饲料中进行添加，以造成产品中蛋白质含量较高的假象［2］。毒理学研究表明，动物长期大量摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，引起肾小管间质性肾炎、膀胱和肾结石，进一步可引起细胞增生并诱发膀胱癌［3］，严重时可引起死亡。2007年3月，美国发生的因宠物食品中添加三聚氰胺而致动物死亡事件；2008年9月，中国发生因婴幼儿食用三鹿婴幼儿奶粉中含有三聚氰胺导致产生肾结石病症的严重事件［2］。从而使人们对动物产品中三聚氰胺的残留及危害引起重视。

1 三聚氰胺毒理学作用研究进展

三聚氰胺可以通过消化道被快速吸收，在体内只有少量或没有代谢即通过尿液排出体外，半衰期为4 h～5h［4］。研究发现，通过静脉注射（2mg／kg）或口服（5mg／kg）进入SD大鼠体内后，其迅速经消化道吸收，且在给药后1h血浆峰浓度达到61μg／mL，获得的三聚氰胺在体内的其他药物代谢动力学参数，口服利用率（F）为73%±13%，平均稳态分布体积（Vd）为103mL／kg±13mL／kg，血液清除率（CL）为20 mL／（h·kg－1）±4mL／（h·kg－1），这些数据表明三聚氰胺主要分布于血液和细胞外液中，在大多数组织内没有广泛分布［5］。Chan J Y等［6］对三聚氰胺在体内代谢后，在孕鼠体内的胎盘羊水和哺乳期大鼠分泌的乳汁和胎儿分布的研究中发现，在强饲后0.5h有30%的三聚氰胺在胎儿体内检测到，在2h～3h后有大约20%的三聚氰胺在羊水中测到，母体吸收的三聚氰胺的40%会进入母乳中，并在3h后达到峰值，研究发现三聚氰胺可透过胎盘屏障，进入胎儿体内，同时也会随着母乳排出。Liu G等［7］对3只猕猴（平均体重5.8kg，1只雌性，2只雄性）体内三聚氰胺（口服，1.4mg／kg）的毒物代谢动力学研究发现，在血液中最大浓度可达1 767μg／L±252μg／L，在体内达到最大浓度需要的时间为2.67h±1.16h，在体内的半衰期为4.41h±0.43h，服用三聚氰胺后36h，在血液中检测不到三聚氰胺的存在。Baynes R E等［8］对体内三聚氰胺断奶仔猪（静脉注射，6.13mg／kg）研究发现，其在体内的半衰期大约为4h，血液清除率为110mL／h，平均稳态分布体积为0.61L／kg。对泌乳羊体内的三聚氰胺代谢动力学研究发现，其平均稳态分布体积为单胃动物的6倍，分析其原因可能是瘤胃作为一个额外的储存器［9］，说明了三聚氰胺在复胃动物体内含量高于单胃动物。

目前，三聚氰胺在家畜体内的毒理学作用的研究数据很有限。无可见有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）作为评价某种有害物质对动物机体危害的统计学数据在对有害物质进行风险分析时有重要参考价值。三聚氰胺的NOAEL在奶牛体内是每日27mg／kg，在猪是每日400mg／kg，而对鲑鱼、鳟鱼、鲶鱼、罗非鱼等约为每日400mg／kg，猫体内是每日180mg／kg［10］。对于人类的研究则是基于2008年在中国发生的婴儿奶粉掺假事件导致婴儿产生肾结石，欧洲食品安全局CONTAM小组通过构建基于婴儿出生体重及每日摄取的三聚氰胺的数据模型估计出的10%肿瘤发生率的低侧可信限（benchmark dose lower confidence limit，BDML10）是每日0.74mg／kg［3］。

针对出现的三聚氰胺出现的食品安全事件，世界各卫生监督机构纷纷对三聚氰胺设立标准，美国食品与药物管理局针对三聚氰胺及其类似物设置的每日容许 摄 入 量 （tolerable daily intake，TDI）是 0.63 mg／kg，欧盟委员会设立的 TDI是2.5mg／kg，世界卫生组织针对三氯氰胺设立的TDI是每日0.2 mg／kg［3］。我国在2008年10月7日颁布《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准GB／T 22388－2008，标准规定了高效液相色谱法、气相色谱－质谱联用法、液相色谱－质谱／质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为2、0.05、0.01mg／kg。

2 三聚氰胺检测方法进展

传统的三聚氰胺检测方法主要有苦味酸法和升华法，主要针对工业用三聚氰胺的检测。随着三聚氰胺在宠物食品和婴儿奶粉中出现等食品安全事件的发生，三聚氰胺在食品中新检测方法不断涌现。同时，国家标准也规定了以高效液相色谱法、气相色谱－质谱联用法、液相色谱－质谱／质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法。

2.1 国家规定的检测方法

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱，是目前对三聚氰胺进行检测的国标方法。操作中先将样品进行预处理后经C8色谱柱的分离后，加入流动相为乙腈－缓冲液（10 mmol／L柠檬酸，10mmol／L辛烷磺酸钠，调节pH至3.0）＝15∶85，检测波长240nm，用紫外检测器进行检测和定量，此法的量限为2mg／kg［2］。有报道采用乙腈－缓冲液为提取液，再用MCX柱净化后进行HPLC分析，饱和醋酸铅可较好的沉淀食品中的大量的蛋白类物质。MCX柱与三聚氰胺的有效结合，可被0.1mol／L的盐酸溶液和甲醇溶液所淋洗下来，因此可有效适用于食品样品的净化处理［10］。

气相色谱－质谱联用法（gas chromatography－mass spectroscopy，GC－MS）是利用气相色谱柱根据试样组分分子的化学性质差异对化合物进行分离，再利用质谱法对分离得到的分子进行离子化并并通过其质荷比来鉴定。2007年6月14日农业部发布了三聚氰胺的标准检测方法（NY／T 1372－2007），规定测定饲料中三聚氰胺含量的HPLC方法和GC－MS法，GC－MS作为阳性确证法［11］。吕燕等［12］建立了鸡蛋中三聚氰胺气相色谱－质谱分析方法，灵敏度达到0.005 mg／kg；研究发现饲喂三聚氰胺饲料后的鸡蛋中三聚氰胺含量快速上升，最高达到3.88mg／kg（A组）和16.28mg／kg（B组），停喂后鸡蛋中三聚氰胺含量则快速下降。

液相色谱－质谱法（liquid chromatography－mass spectrometry，LC－MS）是先采用液相色谱技术对样品进行前期分离，然后用质谱方法对不同LC洗脱成分进行分析的方法。此法广泛应用于生物材料的三聚氰胺检测。已有研究者建立了猪肉、鱼肉、肾脏组织中三聚氰胺检测的LC－MS方法，能快速有效地发现这些组织中三聚氰胺的残留，可用于动物产品中残留的检测［13－15］。Wu Y T等［16］使用 LC－MS方法分别对饲喂三聚氰胺SD大鼠的血浆、肝脏、肾脏、脾脏、膀胱和大脑组织中残留三聚氰胺进行检测，其检测极限（limit of detection，LOD）分别为5.6、8.9、7.2、4.2、5.4、8.3ng／mL，同时进一步证实肾脏是三聚氰胺残留量最高的器官。吴庆庆等［17］发展了一种反相液相色谱－质谱的三聚氰胺检测方法，其主要采用一种质谱兼容离子对试剂七氟丁酸（HFBA），可使三聚氰胺在反相液相色谱上被保留和分离，且不干扰质谱的在线检测。其对三聚氰胺的检测限量为0.1ng／g，在液态奶中限量为8ng／g。李秀琴等［18］使用LC－MS方法对14种食品残留的三聚氰胺进行检测，系统的考察了不同蛋白沉淀剂和提取剂的回收率，发现鲜蛋及蛋制品适合于用乙腈作为蛋白沉淀剂，乙腈水溶液作为提取溶剂效果较好。

2.2 其他方法

亲水作用液相色谱法（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是一种使用极性化合物作为正相液相色谱柱，如硅胶柱，适合用于分离强极性碱性有机物，而避免的反相柱液相色谱法中强极性化合物在柱中不能保留或保留很少的弊端。Zheng X L等［19］用NH2柱，利用乙腈－H3PO4作为流动相，并在215nm的紫外下对乳品中的三聚氰胺进行检测，建立的方法的检测限量是3mg／mL。

酶联 免 疫 吸 附 试 验 （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）也可用于动物产品中三聚氰胺残留的检测，其主要是用三聚氰胺—辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶合物作为标准品，与样品中萃取的三聚氰胺和三聚氰胺－HRP酶偶合物与三聚氰胺抗体结合；经过30min的培养，任何没有结合的三聚氰胺和HRP酶偶合物将被冲洗掉，显色酶底物加入微孔中，任何结合的酶偶合物都会显色；等反应结束后，用酶标仪读数，再将未知样品的读数和标准品的读数比较，就能得出样品中三聚氰胺浓度［11］。Liu J X等［20］对肌肉组织用氨乙腈进行处理后，在ELISA反应之前通过微孔对样品进行提纯，该法检测三聚氰胺的限量是1.8ng／g。Wang Z Y等［21］建立一种用于猪肉和鸡肉中三聚氰胺残留检测的ELISA方法，检测限量是0.05μg／mL，其用所建立的方法检测家兔体内血浆、肌肉、肝脏和肾脏中三聚氰胺残留量，发现在相同的三聚氰胺饲喂量下，肾脏组织中的测到的残留量远远高于其他器官；停止喂给三聚氰胺7d后对相同的组织器官的三聚氰胺残留量进行检测发现，三聚氰胺的浓度快速下降，只有肾脏可以测到少量残留。这些结果也证实了关于动物在暴露于少量三聚氰胺污染的环境下，动物可食性机体组织对人类不构成危害的报道。

高锰酸钾氧化吖啶红荧光动力学法是一种基于在酸性条件下，高锰酸钾氧化吖啶红的褪色效应可被三聚氰胺所抑制，而吖啶红可以产生荧光而被检测到。Feng W等［22］建立的该方法对液态奶进行检测，其检测到的限量是61.5ng／L，此种方法简单，但是易受外界杂质如蛋白的干扰，因此在一定程度上限制了应用。

3 小结

三聚氰胺本身是一种化工原料，经不同途径进入动物产品或动物饲料，被食用后可引机体的起多种损害，主要表现为肾脏中有结晶出现，试验条件下试验动物还会出现尿毒症，以及多种临床表现，如厌食、呕吐、嗜睡、多尿、氮质血症等。同时，有研究发现三聚氰胺还可以导致精子畸形率的增加以及DNA损伤［23］。关于人类在食用含有三聚氰胺残留的动物产品后其在体内的毒理学作用研究资料还不是很多，还需要进一步研究其对人体健康更深远的危害。目前，检测三聚氰胺的方法主要是利用色谱法，但其操作不够简便、成本较高限制了在基层的应用。因此，建立快速、敏感、低成本、适用于临场检测的检测方法是一个重要的方面。另外，待检样品的前期处理对结果影响很大，尤其是生物性样品。因此，针对不同样品材料的前期处理摸索无疑成为一项重要任务。

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