醛固酮受体拮抗剂对心肌细胞凋亡的影响

许香梅 任晓敏 刘曙光 刘海云 王晓燕 董士民

心肌细胞凋亡是急性心肌梗死后心室重构的重要因素，醛固酮可通过多种途径引起细胞凋亡，参与心室重构［1］。而细胞凋亡调控基因最受关注是Bcl-2家族，Bcl-2、Bax基因是Bcl-2家族的成员，为心肌细胞凋亡相关基因［2］，本研究旨在评价醛固酮受体拮抗剂螺内酯对急性心肌梗死后心肌细胞凋亡率、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与方法 通过结扎左冠状动脉前降支造成大鼠左室大面积心肌梗死。将术后2 d存活的大鼠72只随机分为假手术组(Sham组n=24)和心肌梗死组(n=48)。心肌梗死组随机分为:AMI对照组(AMI组，0.9%氯化钠溶液 2 ml·d－1灌胃，n=24)和螺内酯组(Spi组，螺内酯 20 mg·kg－1·d－1灌胃，n=24)。3个组分别于术后的2、7、14、21 d取材，用于流式细胞学检测。用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，迅速开胸，取出心脏，冰上操作，4℃经高压处理的二氧哌嗪甲酰氯(DEPC)水中洗去残余血液，剪取左室非梗死区心肌组织约100 mg，放入75%的乙醇中保存用于流式细胞学检测。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型制作 大鼠称重，经3%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg腹腔内注射)，并给予阿托品0.1 mg/kg腹腔注射。作气管插管，接小动物呼吸机(由江西省特力麻醉呼吸设备公司生产)。取前胸正中切口，在3～4肋间进入胸腔，分离心包，从剑突下方向胸腔方向及从两侧胸壁后方向上方适度挤压，使心脏跳出胸腔，在右室流出道与左心房之间，距主动脉根部2～3 mm处用丝线(7-0)穿过左冠状动脉前降支，在心肌梗死组连同一小束心肌一起结扎，以心脏表面颜色即刻变化，术后心电图J点抬高判断造模成功。然后逐层关胸。撤掉呼吸机，自主呼吸平稳后，拔出气管插管，逐层缝合。假手术组(Sham组)只穿线绕过冠状动脉前降支而不结扎。术后大鼠保温，单笼放置，待清醒后再次称重，编号，按组分笼饲养。

1.3 观察指标 流式细胞方法测定细胞凋亡率及BCL-2、Bax基因蛋白表达:取以上制备好的单细胞悬液，通过间接荧光法进行标记。先分别加入兔抗鼠Bcl-2、Bax蛋白抗体，室温孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液(PBS)10 ml洗涤1次，弃去上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上机检测。同时以PBS代替一抗作为阴性对照，用流式细胞仪测定样品中Bcl-2、Bax蛋白，将采集的数据输入计算机进行处理，以荧光指数(fluorescence index，FI)表示蛋白的相对含量。FI=(样品的平均荧光强度－对照样品的平均荧光强度/正常组织平均荧光强度－对照样品的平均荧光强度)。

1.4 统计学分析应用SPSS 13.3统计软件，计量资料以表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 螺内酯对大鼠非梗死区心肌细胞凋亡的影响 流式细胞检测结果:与Sham组相比较，AMI组和Spi组大鼠非梗死区心肌细胞凋亡率在2、7、14、21 d均显著升高(P＜0.01);与 AMI组比较，Spi组大鼠非梗死区心肌细胞凋亡率14、21 d有所降低(P＜0.05)。见表1。

表1 3组大鼠非梗死区心肌细胞凋亡率变化n=6，%，±s

表1 3组大鼠非梗死区心肌细胞凋亡率变化n=6，%，±s

注:与 Sham 组比较，*P ＜0.01;与 AMI组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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2.2 螺内酯对大鼠非梗死区心肌细胞BCL-2、Bax蛋白表达的影响 与Sham组相比较，AMI组大鼠非梗死区心肌细胞BCL-2蛋白表达在2、7、14、21 d 均显著降低(P＜0.01)，Bax蛋白表达在2、7、14、21 d 均显著升高(P＜0.01);与 AMI组比较，Spi组大鼠非梗死区心肌细胞BCL-2蛋白表达在2、7 d差异无统计学意义(P＞0.05)，14、21 d均有所升高差异无统计学意义(P＞0.05);Bax蛋白表达在2、7 d差异无统计学意义(P＞0.05)，14、21 d 均有所降低(P＜0.05)。见表2、3。

表2 3组大鼠非梗死区心肌细胞BCL-2蛋白表达n=6，±s

表2 3组大鼠非梗死区心肌细胞BCL-2蛋白表达n=6，±s

注:与假手术组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与 AMI组比较，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

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表3大鼠非梗死区心肌细胞Bax蛋白表达n=6，±s

表3大鼠非梗死区心肌细胞Bax蛋白表达n=6，±s

注:与假手术组比较，*P ＜0.01;与 AMI组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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3 讨论

急性心肌梗死后心肌细胞凋亡在梗死区和非梗死区均存在，是急性心肌梗死后心室重构的重要因素［2，3］。细胞凋亡是受多种基因调控的程序性死亡，为凋亡信号通路的启动和相关基因的表达，其中Bcl-2基因家族的作用尤为重要。其中重要成员Bcl-2基因目前被认为是最重要的抑制细胞凋亡的基因。在急性心肌梗死后非梗死区Bcl-2蛋白表达明显下降同时Bax蛋白表达明显升高，从而增加心肌细胞凋亡［4］。

本实验显示:大鼠急性心肌梗死后在AMI组2、7、14、21 d心肌细胞凋亡率显著升高，而非梗死区Bcl-2蛋白表达均明显降低，与研究报道［3］一致。提示AMI后心肌细胞凋亡与其Bcl-2蛋白表达呈相反趋势，Bcl-2蛋白的表达抑制AMI后心肌细胞凋亡。一般认为Bcl-2蛋白可以和Bax蛋白结合，形成异源二聚体终止凋亡［5］。Bcl-2蛋白还可通过改变细胞内细胞器的Ca2+流而抑制凋亡［6］。Bax蛋白的表达在大鼠心肌梗死后AMI组 48 h、7 d、14 d、21 d 表达明显增加，这与文献［7，8］一致，提示Bax蛋白的高表达可以促进心肌细胞的凋亡。Bax基因是Bcl-2家族的另一重要成员，与Bcl-2作用相反，促进细胞凋亡。有实验表明冠心病猝死者心肌细胞凋亡数与其Bax蛋白表达的阳性细胞数呈明显正相关［9］。Bax基因可能是通过下调Bcl-2基因，升高细胞内Ca2+诱发细胞凋亡［10］。

本实验显示:Spi组对大鼠急性心肌梗死非梗死区心肌细胞BCL-2蛋白表达随时间延长逐渐升高，分别升高6.3%、17%;心肌细胞凋亡率及Bax蛋白表达逐渐降低。提示螺内酯可能通过增加Bcl-2蛋白表达，减弱Bax蛋白表达，提高Bcl-2/Bax蛋白比率，而抑制心肌细胞凋亡，改善急性心肌梗死后心室重构。目前研究显示引起细胞凋亡机制，可能与炎性细胞的激活、氧化应激损伤、Ca2+稳态失衡、细胞因子与黏附因子的表达、线粒体损伤有关。螺内酯是醛固酮受体拮抗剂，其抑制心肌细胞凋亡机制可能与下列因素有关:通过降低醛固酮水平，减弱相关转录因子的表达;通过减弱AMI后氧化应激，减轻氧化负荷;抑制炎性介质的表达，如TNF-α的表达;影响Ca2+的内流等机制，抑制细胞凋亡，增加Bcl-2表达，减弱Bax的表达，达到改善心室重构的作用。

急性心肌梗死后，非梗死区心肌细胞凋亡及Bax蛋白的表达增加，Bcl-2蛋白的表达降低;螺内酯治疗可增加大鼠急性心肌梗死非梗死区Bcl-2蛋白的表达和减弱细胞凋亡及Bax蛋白的表达。

1 冯其茂，杨祖福.心肌细胞坏死和凋亡与心肌梗死后心室重构.中国康复理论与实践，2007，13:59-60.

2 Akyurek LM，Johnsson C，Lange D，et al.Tolerance induction ameliorates allograft vasculopathy in rat aortictransplants.Influence of Fas-mediated apoptosis.J Clin Invest，1998，101:2889-2899.

3 Kajstura J，Cheng W，Reiss K，et al.Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats.Lab Invest，1996，74:86-107.

4 马中富，叶任高，罗斌，等.P53和Bcl22基因mRNA在老年急性心肌梗死猝死者心肌细胞凋亡中作用的研究.中国危重病急救医学，2001，13:593-597.

5 Otter I，Conus S，Ravn U，et al.The binding protein properties and biological activities of Bcl22 and Bax in cells exposed to apoptotic stimuli.J Biol Chem，1998，273:6110-6120.

6 Lam M，Dubyak G，Chen L，et al.Evidence that Bcl-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum associated Ca fluxes.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91:6569-6573.

7 Misao J，Hayakawa Y，Ohno M，et al.Expression of Bcl-2 protein，an inhibitor of apoptosis，and Bax，an accelerator of apoptosis，in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction.Circulation，1996，94:1506-1512.

8 Cheng W，Kajstura J，Nitahara JA，et al.Programmed myocyta cell death aftects the risble myocardium after infarction in rats.EXP Cell Res，1996，226:316-327.

9 陈跃峰，杨跃进，阮英茆，等.大鼠急性心肌梗死后心肌细胞凋亡和半胱天冬蛋白酶23的表达及卡维地洛的防治作用.中国循环杂志，2004，19:454.

10 Krown KA，Page MT，Nguyen C，et al.Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in cardiac myocytes.Involvement of the sphingolipid signaling Cascade in cardiac cell death.J Clin Invest，1996，98:2854-2865.