成骨诱导剂对拔牙创愈合的影响

陈俊良 单春城 何芸 夏德林

（1.重庆医科大学附属永川医院 口腔科，重庆402160；2.泸州医学院附属口腔医院 口腔颌面外科，泸州646000）

牙拔除后局部牙槽嵴缺乏牙齿的支持和功能性刺激而发生萎缩、吸收，给牙列修复和种植治疗带来了牙槽骨骨量不足的问题。学者们研究出多种预防牙槽嵴吸收的方法，但由于材料制取复杂、操作烦琐、治疗效果不稳定、费用较高等原因未广泛应用于临床[1]。一定剂量和浓度的地塞米松（10-8mol·L-1）、维生素C（50 mg·L-1）和β-甘油磷酸钠（10 mmol·L-1）组成的试剂能诱导骨髓间充质干细胞（bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨细胞方向分化，促进新骨形成，被认为是经典的成骨诱导剂，已广泛地用于基础和临床医学研究[2]。将其植入拔牙创后，能否诱导牙槽窝内骨的形成，促进拔牙创愈合及防止牙槽骨吸收萎缩，目前尚未见报道。本实验将载有地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的成骨诱导剂的明胶海绵植入拔牙创内，观察牙槽窝内新骨的形成及牙槽骨吸收萎缩情况，来寻找一种操作简捷、价格适宜、便于临床广泛推广的方法来促进拔牙创愈合，减少牙槽嵴的萎缩和吸收。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

3%戊巴比妥钠、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠（Sigma公司，美国）。吸收性明胶海绵（金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，国药准字H3-2024096），在无菌条件下将其剪成0.3 cm×0.3 cm×0.7 cm大小，与拔牙窝相仿，然后浸润由地塞米松（10-8mol·L-1）、维生素C（50 mg·L-1）和β-甘油磷酸钠（10 mmol·L-1）组成的成骨诱导剂。

1.2 实验方法

选用健康雄性家兔50只，体重2.5～3.0 kg，由泸州医学院实验动物科分笼饲养。动物称重后，3%戊巴比妥钠（剂量为30 mg·kg-1）耳缘静脉注射麻醉，常规消毒、铺巾，拔除双侧上颌第一前磨牙，采用同体对照，右侧拔牙创内填入载有成骨诱导剂的明胶海绵，作为实验侧；左侧拔牙创内填入空载明胶海绵，作为对照侧。术后连续3 d肌肉注射青霉素（剂量为每次80万单位，每天2次）。术后前3 d半流质饮食后普通饲料喂养，以防植入物脱落。分别于术后第1、2、4、8、12周时随机处死10只动物，取双侧牙槽骨标本，行大体观察测量和X线片检测后立即于10%中性甲醛中固定，脱钙组织切片，备用。

1.3 影像学检查

术后1、2、4、8、12周拍摄牙槽骨标本X线片，测量各组各时间段标本骨缺损区的新骨密度，骨密度（bone mineral density，BMD）值以单位象素的灰度值（mean grey value，MGV）表示。采用Kodak 2100口腔X射线机及RVG 6000数字成像系统（电压60 kV，管电流7 mA，曝光时间为0．1 s），用平行投照法行数字牙片拍摄。采用Adobe Photoshop CS5软件测量标本数字X线片牙槽窝对应处的灰度值，骨密度越高，越阻射，亮度越高，灰度值即越高，呈对应关系。

1.4 牙槽嵴高度吸收值的测量

测量12周时牙槽嵴高度吸收值，以第二前磨牙远中和第三前磨牙远中牙槽嵴顶连线为参考线，测出拔牙处最低点距离该线的垂直距离，即为牙槽嵴高度吸收值。具体方法为：用直尺表示出牙槽嵴顶连线，用带标记的20号扩锉针标记出拔牙处最低点距牙槽嵴顶连线的距离，用游标卡尺测出具体数值，分别由3人进行测量，每人测3次，计算平均值。

1.5 脱钙石蜡切片的制作和染色

各组标本置于10%中性甲醛中固定，经10%硝酸脱钙，系列脱水，常规石蜡包埋，近远中方向切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光镜观察并采集图像。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，对拔牙创区骨密度和牙槽嵴高度吸收值的测量结果进行配对计量资料比较的t检验。

2 结果

2.1 骨密度的测量结果

实验侧和对照侧骨密度的测量结果见表1。随着时间的增长，两侧拔牙创区骨密度值均有不同程度的增强。术后1周，实验侧和对照侧骨密度差异无统计学意义（P＞0.05）；术后2、4、8、12周，同一时间，实验侧的骨密度值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。术后第8周，实验侧可见清晰骨小梁影像，拔牙窝骨密度与周围正常骨密度接近，新生骨与正常骨界限不明显。对照侧拔牙窝新生骨与正常骨界限明显（图1）。

表1 实验侧和对照侧X线片灰度值比较Tab 1 Comparison of MGV between experiment side and control side n=10

图1 术后第8周，实验侧（上）和对照侧（下）的X线片观察结果Fig 1 X-ray results of experiment side（up）and control group（down）in 8 weeks

2.2 牙槽嵴高度吸收值的测量结果

术后12周时，实验侧和对照侧牙槽嵴高度吸收值分别为（1.43±0.08）、（1.87±0.09）mm，实验侧牙槽嵴高度吸收值小于对照侧，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 组织学观察结果

实验侧和对照侧的组织学观察结果见图2、3。实验侧术后1周即可观察到成骨细胞及成骨趋势，2周时较明显；而对照侧2周时牙槽窝内为大量的血细胞和炎细胞及部分成纤维细胞，为新鲜的肉芽组织。4周时，实验侧牙槽窝已完全为纤维组织所充填，可见成骨细胞增生活跃。大量骨细胞被埋入新形成的骨基质中，形成骨陷窝，部分区域已见近似板层状的类骨质形成。对照侧纤维组织成分增多，在结缔组织中仅有点状骨岛形成，成骨现象较少。8周时，实验侧骨小梁明显较对照侧粗大成熟。12周时，实验侧牙槽窝已充满了成熟的板状新骨；对照侧新生骨才趋向成熟，部分为板层状骨。

图2 实验侧的组织学观察结果 HE×100Fig 2 The histology results of experiment side HE× 100

图3 对照侧的组织学观察结果 HE×100Fig 3 The histology results of control group HE×100

3 讨论

拔牙创愈合是一个动态的复杂过程，是机体骨组织的一种再生修复过程[3]。为了促进拔牙创愈合和新骨形成，笔者采用在拔牙窝中置入成骨诱导剂的方法，结果表明效果是明显的，其机制可能与下列因素有关。1）地塞米松是最常用的成骨诱导因子，可诱导骨髓基质细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，胰岛素样生长因子-1和胶原mRNA的表达，刺激细胞外胶原基质的生物合成、钙的沉积和矿化结节的形成[4]。但高浓度地塞米松（10-6mol·L-1）却会激活细胞表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，抑制BMSCs增殖，从而减少向成骨细胞分化。一般认为地塞米松浓度取10-8～10-10moL·L-1为宜[5]，本实验采用的地塞米松浓度为10-8moL·L-1。在本实验中，1周时实验侧即可见较多成骨细胞，而对照侧未发现，应该与地塞米松的诱导成骨作用相关。2）维生素C能促进细胞合成胶原，形成钙化，同时调节ALP活性。目前认为，ALP能够水解有机磷酸酶，使局部磷酸盐浓度升高，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化，促进成骨。维生素C与许多生长因子有协同作用，可增加其他生长因子对细胞的增殖效应[6]。3）β-甘油磷酸钠可以为成骨细胞提供磷酸离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化。3种因子的共同作用，加速了成骨细胞的分化和增殖，促进拔牙创骨形成。

诱导成骨过程的顺利完成，一般需要3个基本条件：骨诱导因子、靶细胞和良好的局部骨形成环境。拔牙创有着良好的骨形成生物学特性和成骨环境。拔牙创骨壁疏松多孔，血循环丰富，局部抗感染力强。此外，拔牙窝内有较多对骨诱导作用敏感的靶细胞，它们是余留牙周膜中间充质细胞和经血循环从周围骨髓腔进入拔牙创的骨髓基质干细胞[3，7]。明胶海绵作为成骨诱导剂的载体，能很好地维持药物的局部浓度。同时它能促进血液凝固，使血凝块内的活性物质和诱导剂不易散失；纤维蛋白网的存在能够吸引拔牙创内间充质细胞向缺损区迁移，使其与诱导剂充分接触，而促进这些细胞的增殖和分化；其特殊的微孔结构能为未分化的间质细胞迁入和新生血管的长入提供良好支架[8]，增加了生长因子和靶细胞的作用面积，保证了骨组织的再生空间。本实验结果显示：载有成骨诱导剂的明胶海绵置入拔牙创2周后即有新骨生成，成骨细胞分化与增生较对照侧明显活跃，在数量和质量上明显优于对照侧。整个过程中，实验侧拔牙创内成骨现象较对照侧早，成骨细胞分化和增殖更活跃，新骨形成更快。骨密度测量分析显示：实验侧和对照侧拔牙创区骨密度值随时间的增长均有不同程度的增强，同一时间，实验侧的骨密度值高于对照侧。说明在地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C组成的成骨诱导剂的作用下，加速了成骨细胞的分化和增殖，从而促进成骨。

新骨的快速形成能使拔牙创区骨质承受较大压力而不发生变形，也可防止无牙区牙槽嵴因受压时间过长所产生的牙槽骨吸收，从而起到防止牙槽骨高度降低的效果。本实验标本测量结果显示：实验侧牙槽嵴吸收明显少于对照侧，说明该材料可能有保持牙槽嵴形态的作用。

地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C作为经典的成骨诱导剂，能诱导BMSCs向成骨细胞方向分化，促进新骨形成。将载有成骨诱导剂的明胶海绵植入拔牙窝，能促进拔牙创愈合，加速成骨和骨改建，减轻牙槽骨的吸收萎缩。其制取容易、操作简单、费用低廉，易于临床广泛推广。

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