高原低氧环境对兔牙周炎模型血清和牙龈组织中超氧化物歧化酶活力的影响

武曦 黄镜静 张纲 谭颖徽 高钰琪

（1.第三军医大学新桥医院 口腔科；2.第三军医大学高原军事医学系，重庆400037）

氧自由基是机体代谢中的产物，生理情况下，其产生和清除保持动态平衡，不会对机体产生损伤。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是机体对抗氧自由基的第一道防线，其活性直接影响机体内氧自由基的清除。

研究[1-2]表明：在一定程度上牙周炎是自由基产生和清除失衡介导的组织损伤，牙周炎症时，中性粒细胞通过呼吸暴发释放过多的氧自由基，对周围组织细胞产生破坏。高原低氧环境会增加机体的氧化压力，改变组织细胞的代谢，从而造成各种生理病理反应。流行病学调查[3]显示高原地区牙周患病率显著高于其他地区，且炎症程度明显加重，但其具体机制尚不明确。本研究通过建立兔高原牙周炎模型，观察其血清和牙龈组织中SOD活力水平的改变，以探讨SOD和氧自由基在高原牙周病发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料和仪器

中国大白兔（第三军医大学新桥医院实验动物中心提供），速眠新Ⅱ（兽用注射麻药，吉林省华牧动物保健品有限公司），牙菌斑显示片（上海益口佳口腔护理用品有限公司），BCA试剂、SOD活力测试盒（南京建成生物工程研究所），Infinite M200多功能酶标仪（Tecan公司，澳大利亚），DU-800核酸蛋白检测仪（Beckman公司，美国），低压动物舱（第三军医大学高原军事医学系）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及饲养 健康雄性白兔40只，体重（1.9±0.2）kg，随机分为4组，每组10只。其中，常氧对照组为普通饮食常氧常规饲养；常氧实验组建立牙周炎动物模型，常氧常规饲养；低氧对照组为普通饮食低压氧舱饲养；低氧实验组建立牙周炎动物模型，低压氧舱饲养。低氧实验组和对照组动物每天进入模拟海拔5 000 m环境的低压氧舱23 h。

1.2.2 牙周炎动物模型的建立方法 将常氧实验组和低氧实验组动物用速眠新（0.1～0.2 mL·kg-1）经肌肉注射麻醉，采用口腔正畸结扎丝（直径0.25 mm）结扎双下颌中切牙牙颈部一圈，结扎丝尽量靠近龈缘，以不损伤牙龈上皮为宜。定期对动物口腔内状况复查，脱落或移位结扎丝重新结扎。按照Keyes’s diet 2000牙周炎食谱[4]喂养。

1.2.3 动物体重检测 在实验初始、2、4、6、8周清晨空腹时分别称取动物体重，按编号记录。

1.2.4 血清和牙龈组织样本采集 在实验第8周时，取动物清晨空腹耳缘静脉血标本，4 ℃下静置过夜，3 000 r·min-1、4 ℃低温离心15 min取上层血清，分装至无菌EP管中，登记编号，-70 ℃保存备用。取各组动物下颌中切牙周围牙龈组织，4 ℃冰生理盐水漂洗去除血液后，滤纸吸干，-70 ℃保存备用。

1.2.5 牙周各项临床指标检测 实验8周后，检查各组动物下颌中切牙的牙周情况。1）牙龈指数（gingival index，GI）：用牙周探针检测双下颌中切牙，轻探至龈沟或牙周袋底，移出探针后停留1～2 s，观察牙龈出血情况。2）牙菌斑指数（plaque index，PLI）：用棉签蘸取少量菌斑显示液，轻轻地均匀涂于双下颌中切牙牙面、龈缘及邻间隙处，待1～2 min后观察显色情况，采用Loe和Slliness四分度计分标准进行计分。3）附着丧失（attachment loss，AL）：探诊记录牙周袋深度后，探针沿牙面退出探寻釉牙骨质界，记录釉牙骨质界到龈缘的距离，探诊深度减去该距离即为附着丧失，每牙测近中、正中、远中3个位点，两侧牙共6个位点取均值。操作均由同一人完成。

1.2.6 血清和牙龈组织中总SOD（total-SOD，T-SOD）活力测定 血清：将血清复温至室温。牙龈组织：组织块称重后，冰浴速剪置入组织匀浆器中，加入适量冰生理盐水，按组织块重量∶盐水体积为1∶9制备10%组织匀浆，3 000 r·min-1、4 ℃低温离心15 min取上清，再用生理盐水按体积比1∶9稀释成1%的组织匀浆样本，BCA法测定1%组织匀浆样本中总蛋白含量，再按T-SOD活力测试盒说明书对上述血清和组织匀浆标本进行测定，使各组T-SOD抑制率为0.15～0.55，计算各个样本中T-SOD的活力。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。等级资料GI、PLI采用秩和检验，计量资料AL、T-SOD活力以±s表示，组间比较采用方差分析，低氧实验组AL、血清及牙龈组织中T-SOD活力的相关性采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 体重的动态变化

各组兔体重的动态变化见表1。从表1可见，各组动物体重在实验初始时无明显差异，随着时间延长，低氧组动物较常氧组动物体重增长缓慢。8周时常氧实验组和低氧实验组体重较相应对照组增长速度快，具有统计学差异（P＜0.01）；低氧实验组与常氧实验组、低氧对照组与常氧对照组相比，体重也有统计学差异（P＜0.01）。

表1 各组兔体重的动态变化Tab 1 The dynamic change of weights in every group kg

2.2 牙周临床指标

实验8周时，常氧对照组牙周组织肉眼观察无明显变化，多数仅在龈缘区有少量菌斑，用探针可刮出；常氧实验组牙周组织有中度炎症，牙龈红肿光亮，可探及牙周袋，探诊出血（+），多数龈缘或牙面可见中等量菌斑；低氧对照组牙周组织有轻度炎症，牙龈轻度水肿，探诊不出血，多数龈缘或牙面可见少量菌斑；低氧实验组牙周组织有严重炎症，牙龈明显红肿退缩，可探及较深牙周袋，探诊出血（+），有自发出血倾向，在龈缘和牙面可见大量食糜。

各组的PLI、GI结果见表2。统计分析表明：低氧实验组的PLI、GI与低氧对照组和常氧实验组相比，有统计学差异（P＜0.01）；常氧实验组与常氧对照组、低氧对照组与低氧实验组相比，均有统计学差异（P＜0.01）。

表2 各组的PLI、 GI结果Tab 2 The results of PLI and GI in every group

常氧对照组、常氧实验组、低氧对照组、低氧实验组的AL分别为（0.36±0.11）、（2.57±0.23）、（1.30±0.15）、（3.81±0.29）mm。统计分析表明：常氧实验组、低氧对照组的AL与常氧对照组相比，具有统计学差异（P＜0.05）；低氧实验组的AL与常氧实验组、低氧对照组相比，具有统计学差异（P＜0.05）。

2.3 T-SOD活力

各组血清和牙龈组织中T-SOD活力的比较见表3。从表3可见，低氧实验组T-SOD活力较常氧实验组、低氧对照组显著降低，有统计学差异（P＜0.05）；常氧实验组与常氧对照组比较，T-SOD活力也降低，有统计学差异（P＜0.05）。

表3 各组血清和牙龈组织中T-SOD活力的比较Tab 3 Comparison of T-SOD activity in serum and gingival tissues in every group

2.4 低氧实验组AL、血清及牙龈组织中T-SOD活力的相关性

低氧实验组AL、血清及牙龈组织中T-SOD 活力的相关性见表4。由表4可见：血清及牙龈组织中TSOD活力与AL呈负相关（r值分别为-0.980和-0.804，P＜0.01），血清与牙龈组织中T-SOD活力呈正相关（r=0.846，P＜0.01）。这表明，模拟高原条件下牙周炎模型中全身和局部的T-SOD活力均随附着丧失的增加显著降低，全身与局部的改变一致。

表4 低氧实验组AL、 血清及牙龈组织中T-SOD活力的相关系数Tab 4 Coefficient correlation among AL and activity of T-SOD in serum and gingival tissues in hypoxia periodontitis group

3 讨论

高原特殊环境下，机体难以耐受低氧环境，生长和代谢均受到影响，从而产生一系列不适症状。本实验中观察到低氧组动物生长迟缓，在实验8周时，体重出现轻微下降，并显著低于常氧组，这可能与低氧环境下实验动物产生少食倦怠等一系列不适症状有关。高原环境应激因素增多，一方面使分解代谢增强，合成代谢减少，直接增加基础代谢率，另一方面可以引起机体的神经内分泌反应，影响摄食和代谢，从而影响机体的生长发育[5]。

与以往常用的大鼠磨牙牙周炎模型[5]不同，本研究采用正畸结扎兔双下颌中切牙联合牙周炎食谱的方法，实验8周后成功建立兔牙周炎动物模型。此方法便于操作和实时观察，同时局部未接种致病原、注射致炎细胞因子或全身应用激素，使牙周炎致病的多因素局限化，能更有效地研究牙周炎发病过程中的免疫因素。

一些研究[6-7]表明，高原低氧环境对牙周炎的发生、发展有一定影响。在高海拔地区，缺氧会增加机体的氧化压力，影响代谢平衡。生理情况下，氧自由基作为机体代谢的产物，产生和清除保持平衡，吞噬细胞在防御中产生的一定量氧自由基还具有杀菌作用；在感染、损伤等病理情况下，过多氧自由基堆积会对机体产生损伤。牙周炎症时，过多的超氧自由基不能被及时清除，对牙周组织产生损伤。氧自由基的损伤方式主要有以下两种：一是使细胞脂质过氧化，破坏细胞膜上的糖和蛋白，改变细胞和血管通透性，从而影响细胞的代谢和功能，导致细胞变性坏死[8]；二是作为间接细胞信使参与细胞信号转导，调节NF-κB信号通路[9-10]，诱导炎性介质的合成与释放，这些炎症介质又反过来增加氧自由基产生，从而放大炎症反应[10-12]，通过直接破坏牙周组织细胞和间接的免疫损伤导致牙周炎的发生和发展。

机体的抗氧化酶系统有SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）[13]，其中SOD是目前发现的唯一以氧自由基为底物的酶，能使氧自由基歧化为H2O2，再由CAT和GSH-Px催化转化为氧和水。SOD在机体氧化和抗氧化平衡中起关键作用，能直接清除氧自由基，保护组织和细胞免受损伤。高等动物体内含两种SOD，即CuZn-SOD和Mn-SOD，因此T-SOD活力代表机体抗氧化酶系统对氧化的应激能力和清除氧自由基的能力，是反映机体抗氧化能力的标志。SOD作为生物大分子，其活性受到多种因素影响，在感染、辐射、衰老等因素下，其合成和活力均下降，机体清除氧自由基的能力降低，使氧自由基在体内大量堆积，造成组织损伤[14-16]。

本实验通过模拟高原环境建立兔牙周炎模型，发现低氧实验组兔血清和牙龈组织中T-SOD活力较其余各组明显降低（P＜0.05），其活力与AL显著负相关（P＜0.01），且牙龈组织和血清中T-SOD活力呈正相关（P＜0.01）。这些结果表明，与平原常氧环境相比，高原缺氧环境下出现牙周炎症时，T-SOD活力都显著降低，且其活力的改变在局部组织与全身一致，加之中性粒细胞的呼吸暴发，使机体氧自由基相对或绝对增多，这加重了高原环境下牙周组织的破坏，同时这也是加重其他高原病的可能原因。SOD广泛存在于自然界，其活力可受多种方式调节，利用分子修饰和脂质体制备的手段增强SOD活力或作为辅助添加剂[16]，能促进局部组织清除过多有害物质，这为高原环境下牙周炎的预防和治疗提供了新的思路。

[1]Chapple IL,Matthews JB.The role of reactive oxygen and antioxidant species in periodontal tissue destruction[J].Periodontol 2000,2007,43:160-232.

[2]D’Aiuto F,Nibali L,Parkar M,et al.Oxidative stress,systemic inflammation,and severe periodontitis[J].J Dent Res,2010,89（11）:1241-1246.

[3]肖娴,张纲,李焰,等.驻高原和平原官兵口腔健康状况调查[J].解放军预防医学杂志,2010,28（1）:40-41.

Xiao Xian,Zhang Gang,Li Yan,et al.The research of oral health in soldiers in plateau and plain[J].J Preventive Medicine Chin People’s Liberation Army,2010,28（1）:40-41.

[4]吴世莲,刘丽.牙周炎动物模型的研究概况[J].口腔医学,2006,26（5）:385-387.

Wu Shilian,Liu Li.The overview of research on periodontitis animal models[J].Stomatology,2006,26（5）:385-387.

[5]王宏运,刘宁,胡耀文,等.高原低氧环境对人体生长发育和营养状况的影响[J].西北国防医学杂志,2008,29（4）:289-291.

Wang Hongyun,Liu Ning,Hu Yaowen,et al.Growth and development of human body and nutrition status in the environment of plateau and hypoxia[J].Medical J National Defending Forces Northwest China,2008,29（4）:289-291.

[6]肖娴,孔燕,张纲,等.模拟高原低氧环境下大鼠牙周炎致病菌多样性的实验研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2009,19（9）:517-520.

Xiao Xian,Kong Yan,Zhang Gang,et al.The pathogenic bacteria diversity of rat periodontitis in imitative plateau environment:An experimental study[J].Chin J Conserv Dent,2009,19（9）:517-520.

[7]孔燕,肖娴,张纲,等.模拟高原条件下大鼠龈沟液中TNF-α、PGE2、IL-8与牙周炎的相关性研究[J].实用口腔医学杂志,2010,26（5）:602-604.

Kong Yan,Xiao Xian,Zhang Gang,et al.Relationship between inflammatory cytokines in gingival crevicular fluid and periodontal clinical status in periodontitis rat model when exposed to hypoxia at high altitude[J].J Pract Stomatol,2010,26（5）:602-604.

[8]Kulbacka J,Saczko J,Chwilkowska A.Oxidative stress in cells damage processes[J].Pol Merkur Lekarski,2009,27（157）:44-47.

[9]Morgan MJ,Liu ZG.Crosstalk of reactive oxygen species and NFκB signaling[J].Cell Res,2011,21（1）:103-115.

[10]Roebuck KA.Oxidant stress regulation of IL-8 and ICAM-1 gene expression:Differential activation and binding of the transcription factors AP-1 and NF-kappa B[J].Int J Mol Med,1999,4（3）:223-230.

[11]Morgan MJ,Liu ZG.Reactive oxygen species in TNF alpha-induced signaling and cell death[J].Mol Cells,2010,30（1）:1-12.

[12]Lu Y,Wahl LM.Oxidative stress augments the production of matrix metalloproteinase-1,cyclooxygenase-2,and prostaglandin E2 through enhancement of NF-kappa B activity in lipopolysaccharide-activated human primary monocytes[J].J Immunol,2005,175（8）:5423-5429.

[13]张海元,刘鲁川.氧自由基与牙周炎关系研究进展[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2009,19（1）:46-49.

Zhang Haiyuan,Liu Luchuan.Progress on the relationship between oxygen-derived free radical and periodontitis[J].Chin J Conserv Dent,2009,19（1）:46-49.

[14]Wei D,Zhang XL,Wang YZ,et al.Lipid peroxidation levels,total oxidant status and superoxide dismutase in serum,saliva and gingival crevicular fluid in chronic periodontitis patients before and after periodontal therapy[J].Aust Dent J,2010,55（1）:70-78.

[15]Poliakova VV,Raksha NH,Drahan LP,et al.Effect of riboxine on processes of lipid peroxidation and activity of antioxidant enzymes in thymocytes of rats with radiation injury[J].Ukr Biokhim Zh,2010,82（4）:48-52.

[16]Alvarado C,Alvarez P,Jiménez L,et al.Oxidative stress in leukocytes from young prematurely aging mice is reversed by supplementation with biscuits rich in antioxidants[J].Dev Comp Immunol,2006,30（12）:1168-1180.