重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析*

林影 周新莹 韩双艳 张莉 叶燕锐 郑穗平

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006)

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种甲醇营养型酵母具有很多优点，已有数百种外源蛋白实现了在毕赤酵母中的高效表达［1-2］.巴斯德毕赤酵母细胞在甲醇诱导培养时响应细胞变小，细胞壁增厚［3］.笔者对甲醇诱导毕赤酵母外源蛋白表达的RNA-Seq与数据分析结果表明:61个预测的毕赤酵母糖基化磷脂酰肌醇(GPI)细胞壁蛋白基因中，有24个基因的表达水平(RPKM)大于全基因表达的平均水平(约为130)，其中:11个预测的GPI蛋白基因的表达水平在前5%，表达量最高的GPI细胞壁蛋白基因PAS_chr1-4_0586的 RPKM值高达14977，在所有基因表达水平中排第2位，该蛋白已被确证为GPI型细胞壁锚定蛋白［4］.这一研究结果引起笔者研究毕赤酵母细胞壁蛋白质组的极大兴趣.

近年来，研究方法和技术的提升已为微生物细胞壁蛋白质组学的研究打开了一扇大门［5］.酵母已成为真核微生物细胞壁蛋白质组学研究的重要对象，如:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)［6］、白假丝酵母(Candida albicans)以及光滑假丝酵母(Candida glabrata)等［7-9］，这些酵母细胞壁蛋白质组分析为致病菌病源发生机制及致病靶蛋白的研究提供了基础.工业微生物蛋白质组学及细胞器蛋白质组研究的深入展开，为微生物代谢调控的研究提供了帮助［10］.de Groot等［11］对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞壁共价键结合蛋白的质谱分析研究表明，S.pombe细胞壁结合蛋白含丰富的GPI壁蛋白和碱敏感壁蛋白.

文献［12］报道了乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)细胞壁蛋白组的研究结果，其与P.pastoris为相似的Crabtree-negative酵母.Qing等［13］对酿酒酵母19种共价结合的细胞壁蛋白进行了蛋白质组学鉴定和分析，其中包括12种GPI型、4种蛋白内部重复(PIR)型以及3种类似PIR型的细胞壁蛋白.Castillo等［7］对白色念珠菌中21种细胞壁蛋白进行蛋白组学分析和讨论，其中19种为GPI型共价结合方式，并确定了其中某些细胞壁蛋白的功能.

据报道，酵母细胞表面的性质主要是由细胞壁的甘露糖蛋白决定的［14］，稳定的细胞壁蛋白(CWPs)提取方法是细胞壁蛋白组研究的关键一步，常用的细胞壁甘露糖蛋白的抽提方法有:(1)热十二烷基磺酸钠(SDS)或β-巯基乙醇/二硫苏糖醇(DTT)等还原性试剂抽提法，主要用于抽提由氢键等非共价或二硫键连接细胞壁的甘露糖蛋白，如酿酒酵母絮凝素Flo1p［15］;(2)昆布多糖酶可水解提取与细胞壁葡聚糖通过共价键相连的细胞壁甘露糖蛋白，包括GPI型和PIR型两种不同类型的甘露糖蛋白［16］; (3)氢氟酸吡啶(HF-pyridine)可用于抽提GPI型壁蛋白(GPI-CWPs)，主要作用为切断GPI锚中的磷酸二酯键［14］;(4)温和碱处理可以抽提PIR型细胞壁甘露糖蛋白(PIR-CWPs)［17］.但是，上述方法主要针对不同微生物细胞分别建立，未能比较讨论这些方法的适用范围及提取效果.并且不同酵母细胞及其在不同生理条件下的细胞壁蛋白的组成和结构均存在较大的差异.

为探索稳定和可靠的各种毕赤酵母细胞壁蛋白的提取方法，本研究以含非共价结合型细胞壁蛋白的重组酵母GS115/KFS-CALB、共价结合型GPI壁蛋白重组酵母GS115/KNS-CALB以及共价结合型PIR壁蛋白重组酵母GS115/Pir1-CALB为研究对象，建立适用毕赤酵母不同锚定方式的细胞壁蛋白的有效提取方法，以期为毕赤酵母细胞壁蛋白质组学的进一步研究提供技术支持.

1 实验材料与方法

1.1 材料

基于Flo1p絮凝素锚定系统的重组毕赤酵母GS115/KFS-CALB、α凝集素锚定系统GS115/KNSCALB、Pir1壁蛋白锚定系统GS115/Pir1-CALB，均由华南理工大学微生物酶学实验室保存.主要试剂有:昆布多糖酶、氢氟酸吡啶、去N糖基化酶、蛋白酶抑制剂混合物、C4底物，均购自广州瑞斯生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 重组毕赤酵母的培养

将构建的重组毕赤酵母接种于酵母甘油培养基(BMGY)的500mL摇瓶中，装液量为10%，28℃下250r/min培养16～18h至D(600)=5.用灭菌离心管在室温下3000 g离心5 min收集细胞，酵母甲醇培养基(BMMY)重悬细胞至D(600)=1时进行诱导.每24h加甲醇至终浓度为1%，直至最佳诱导时间.取D(600)=40时的酵母进行细胞壁蛋白抽提.

1.2.2 免疫荧光显微镜分析

将表面结合有重组蛋白的毕赤酵母用IX71型荧光显微镜(上海精科雷磁实业有限公司生产)观察，具体方法见文献［18］.

1.2.3 脂肪酶酶活测定

检测重组毕赤酵母表面及细胞培养上清的脂肪酶酶活，具体方法见文献［19］.

1.2.4 细胞壁分离

将收集的细胞进行细胞壁的分离，具体方法见文献［19］.

1.2.5 细胞壁甘露糖蛋白的抽提

将上述分离的GS115/KFS-CALB、GS115/KNSCALB和 GS115/Pir1-CALB的细胞壁中均加入600μL的SDS缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH= 7.8)、100mmol/L EDTA、2%SDS、40mmol/L β-巯基乙醇)，100℃煮沸20 min，常温下14000 r/min离心10min，上清即SDS法抽提的细胞壁蛋白［15］.沉淀用上述缓冲液洗涤3次，加入60 μL乙酸钠缓冲液(pH=5.5)，再加入约0.2U昆布多糖酶，于37℃培养箱孵育4 h或过夜，常温下14 000 r/min离心10min，上清即昆布多糖酶法抽提的细胞壁蛋白［16］.将SDS抽提之后的沉淀洗涤之后，加入70μL氢氟酸吡啶混匀，于0℃孵育3h，14000r/min离心10min，取上清，加入630 μL 100%甲醇缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.8，溶于100%甲醇溶质中)析出壁蛋白，再于0℃孵育2 h，14000 r/min离心10 min去除上清，沉淀用90%甲醇缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.8，溶于90%甲醇溶质中)洗涤3次之后，加入2%SDS上样缓冲液，用于SDS-PAGE分析，即为氢氟酸吡啶法抽提的细胞壁蛋白［14］.若将SDS抽提之后的沉淀洗涤之后加入30 mmol/L NaOH溶液，于4℃孵育17h，然后以14000r/min离心10min，取上清则为温和碱法抽提的细胞壁蛋白［18］.

1.2.6 壁蛋白去糖基化处理

细胞壁蛋白提取液于糖蛋白变性缓冲液(含5%SDS，400 mmol/L二硫苏糖醇)中100℃煮沸10min使糖蛋白变性.再在加入1%NP-40的1×G7反应缓冲液(50mmol/L磷酸钠，pH=7.5，25℃)的去N糖基化酶中于37℃温育，所得样品即可用于后续的酶切反应.

1.2.7 融合壁蛋白SDS-PAGE和Western Blot分析

将上述用各种方法抽提的细胞壁重组蛋白以及去除N糖基化的样品用SDS-PAGE分析，采用半干转印槽(Bio-Rad)，进行Western Blot鉴定，4℃封闭过夜后，用与Flag标签反应的一抗(1∶1000)Rabbit anti-FLAG IgG抗血清孵育2h，再于结合了辣根过氧化物酶的二抗(1:5000)Goat anti-rabbit中孵育1 h.经过曝光、显影和定影后，可得特异性结合抗体的融合壁蛋白.

2 结果

2.1 融合壁蛋白在毕赤酵母细胞表面的展示

对毕赤酵母表面3种不同类型的细胞壁蛋白(絮凝功能域结合型、GPI共价结合型、PIR共价结合型)进行了研究，利用毕赤酵母表面展示系统将携带Flag标签的报告蛋白南极假丝酵母脂肪酶B (CALB)分别与上述壁蛋白融合，运用免疫荧光显微镜技术鉴定外源蛋白，描述融合壁蛋白锚定于毕赤酵母表面的情况.

将非共价结合型酵母GS115/KFS-CALB、GPI共价结合型酵母GS115/KNS-CALB、PIR共价结合型酵母GS115/Pir1-CALB于BMMY中摇瓶培养，甲醇诱导120h取样，采用免疫荧光显微镜对其进行鉴定.以宿主菌 P.pastoris GS115为空白对照，鼠源Flag单克隆抗体作为一抗，Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG作为二抗，在波长为492 nm的激光下激发，520nm波长处有吸收峰.经免疫荧光显微镜检测发现，重组毕赤酵母GS115/KFS-CALB、GS115/ KNS-CALB、GS115/Pir1-CALB细胞壁表面均产生绿色荧光，宿主菌P.pastoris GS115表面无荧光产生(见图1).表明3种类型融合壁蛋白(非共价结合型、GPI共价结合型、PIR共价结合型)已成功地展示于毕赤酵母细胞壁的表面.

图1 带标记重组毕赤酵母的荧光显微照片Fig.1 Fluorescence microscope images of labeled recombinant Pichia Pastoris

2.2 重组毕赤酵母生长与融合蛋白的表达

将含有报告蛋白CALB的重组毕赤酵母GS115/ KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和 GS115/Pir1-CALB接种于BMMOL/LY摇瓶中培养，观察重组酵母的生长情况和融合蛋白的表达，融合蛋白的表达量用CALB酶表达量表征，以宿主菌P.pastoris GS115为空白对照.结果见图2(a)，随时间增加，菌体D(600)值也逐渐增加;甲醇诱导72h之后，菌体呈平稳增加的趋势.

图2 重组毕赤酵母生长曲线及酶活曲线Fig.2 Growth and enzymic activity curves of recombinant Pichia Pastoris

甲醇诱导后，3种重组毕赤酵母菌体表面均存在CALB水解酶活性，并且随着时间的增加而增强，尤其在诱导的48～96h之间，单位水解酶活性增加幅度最大，96h之后则增速减缓(见图2(b)).其中，虽然同一种融合脂肪酶以同一种毕赤酵母作为宿主，但是融合壁蛋白的差异却使脂肪酶在酵母表面的展示效果存在很大差别，这与张溪等［19］的研究结果一致.菌体生长趋势几乎相同的3种重组菌中，PIR共价结合型酵母GS115/Pir1-CALB菌体的脂肪酶水解比酶活最低，其最高值达到210.47 U/g(以干细胞计，余同);非共价结合型酵母GS115/KFS-CALB和GPI共价结合型酵母GS115/KNS-CALB菌体的脂肪酶水解比酶活在诱导后各个时段均比GS115/Pir1-CALB高，最高值分别达855.02 U/g和1239.40 U/g.张溪等［19］的研究结果也表明，GS115/KFS-CALB的菌体表面酶活力较GS115/KNS-CALB低，推测可能是锚定蛋白结合细胞壁的能力有所不同引起的.

上述结果表明，用毕赤酵母不同结合类型的锚定蛋白展示脂肪酶，对细胞的生长状况影响不大，而对展示酶的表达量存在较大影响.

2.3 毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提

为稳定有效地获取毕赤酵母不同类型的细胞壁蛋白，研究了毕赤酵母细胞有效破碎的条件，经试验确定每毫升酵母细胞壁破碎使用的玻璃珠量为730mg，在常温下，破碎30s后间隔1min作用8次，细胞破碎率达98.3%.离心收集细胞壁碎片，分别采用改进的热SDS抽提法、昆布多糖酶抽提法、氢氟酸吡啶抽提法和温和碱抽提法提取细胞壁甘露糖蛋白(如图3所示)，利用SDS-PAGE和Western Blot技术对各种抽提法获得的重组壁蛋白进行分析.

图3 毕赤酵母细胞壁蛋白抽提流程示意图Fig.3 Schematic diagram of the extraction procedure of cell wall proteins of Pichia Pastoris

从图4中各图上部分SDS-PAGE电泳图中蛋白条带的深浅可以判断各种方法抽提等量的酵母细胞壁蛋白的效率，通过比较发现:热SDS法能较有效地抽提非共价键结合壁蛋白，昆布多糖酶法能较有效地抽提共价键结合的细胞壁蛋白(GPI型和PIR型);而氢氟酸吡啶法和温和碱的抽提效率相对较低，这将会直接影响毕赤酵母细胞壁蛋白质组的分离效率，可能造成低丰度壁蛋白的提取困难.因此，热SDS抽提法和昆布多糖酶抽提法可作为进一步的毕赤酵母细胞壁蛋白质组研究的基本方法.

图4 重组毕赤酵母细胞壁蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of cell wall proteins of recombinant Pichia Pastoris M—蛋白标准物;K—昆布多糖酶法;W—温和减法; Q—氢氟酸吡啶法;S—热SDS法;T—去N糖基化

结果显示(见图4各图下部分):在含2%SDS的抽提缓冲液中，非共价结合型酵母GS115/KFSCALB煮沸10min处理，得到表观相对分子质量为200000的细胞壁蛋白;在氢氟酸吡啶溶液中，GPI共价结合型酵母GS115/KNS-CALB冰浴3 h处理，得到相对分子质量为200 000的细胞壁蛋白;在30mmol/L的NaOH中，PIR共价结合型酵母GS115/ Pir1-CALB于4℃过夜处理，得到相对分子质量为100000的细胞壁蛋白;在昆布多糖酶溶液中，GS115/KNS-CALB、GS115/Pir1-CALB于37℃孵育4h，则可分别得到相对分子质量分别为200000和100000的细胞壁蛋白，而其它抽提方法得到的相应细胞壁蛋白则无法由蛋白印迹鉴定到目的蛋白.

由此说明，热SDS可以抽提毕赤酵母GS115/ KFS-CALB非共价结合型的细胞壁蛋白Flo1p;氢氟酸吡啶和温和碱可分别释放GS115/KNS-CALB中GPI型共价结合细胞壁蛋白 α凝集素和 GS115/ Pir1-CALB中PIR型共价结合细胞壁蛋白Pir1;而昆布多糖酶可同时释放毕赤酵母GS115/KNS-CALB、GS115/Pir1-CALB中两种共价结合类型(GPI型和PIR型)的细胞壁蛋白α凝集素和Pir1.

2.4 毕赤酵母细胞壁蛋白的糖基化

在建立酵母不同类型细胞壁蛋白抽提方法的过程中，抽提得到的重组蛋白表观相对分子质量与预测值不一致，去除N糖基化后相对分子质量有所减小，说明3类锚定蛋白存在N糖基化且N糖基化程度不同，这为深入研究不同壁蛋白糖基化的原理奠定了基础.

重组毕赤酵母GS115/KFS-CALB、GS115/KNSCALB、GS115/Pir1-CALB的重组蛋白分别由1191、967、658个氨基酸组成，其预测相对分子质量分别是131 000、106 000、72 000.SDS-PAGE和 Western blot鉴定结果(见图4)表明，不同抽提方法得到重组蛋白的表观相对分子质量均比预测值高出很多，这与之前的报道一致［18］.

为分析造成重组蛋白表观相对分子质量与预测值之间差异的原因，本研究利用去N糖基化酶PNGase F，将不同方法抽提的重组细胞壁蛋白去除N糖基化，以此初步分析其糖基化状况(见图4).经SDS-PAGE及Western Blot鉴定，发现去除N糖基化后，重组蛋白表观相对分子质量比之前有所减小，但并不明显，说明这3种类型重组蛋白均存在较小程度的N糖基化.这与Tanino等［20］的研究结果相似.重组毕赤酵母GS115/KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和GS115/Pir1-CALB的细胞壁蛋白去除N糖基化之后，表观相对分子质量与预测值还存在差异，O糖基化修饰作用可能是引起其表观相对分子质量增加的一个原因.

3 结语

本研究以重组非共价结合壁蛋白酵母GS115/ KFS-CALB、重组GPI共价结合壁蛋白酵母GS115/ KNS-CALB和重组PIR共价结合壁蛋白酵母GS115/ Pir1-CALB为研究对象，对不同方式结合于酵母细胞壁的重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提效果进行分析，结果表明，热SDS法可有效地抽提毕赤酵母非共价键结合壁蛋白，昆布多糖酶法可有效地抽提毕赤酵母共价键结合壁蛋白.由此可见，借助文中提供的热SDS抽提法和昆布多糖酶抽提法对细胞壁蛋白进行抽提分类，进一步结合高分辨率液相色谱和质谱分析技术，可有效和特异地鉴定毕赤酵母细胞壁蛋白组成，进而分析其功能.

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