同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究

杨文奇，毛淑丹，陶贵周

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000)

急性心肌梗死(AMI)是目前我国发病率、病死率较高的重大疾病之一，AMI后可致大量无功能心肌形成，梗死区域最终被瘢痕组织代替并逐步发生心室重构而导致心力衰竭，其最基本的病理改变是具有完整舒缩功能的心肌细胞坏死或凋亡致瘢痕组织形成。目前，再灌注疗法在临床中广泛开展，虽可使闭塞血管再通，但无法使已坏死的心肌细胞再生。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，其分化方向和分化能力是全能的，可形成包括所有组织的有机体。随着生命科学的发展，干细胞移植替代坏死心肌己成为目前心肌梗死治疗领域备受关注的热点。2010年6月～2012年6月，本研究观察了同种异体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)移植治疗AMI的疗效，评价其对梗死区毛细血管增生和非梗死区心肌细胞凋亡的影响，以探讨BMMSCs治疗AMI的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雌性Wistar大鼠30只，体质量(215±25)g，由辽宁医学院实验动物中心提供。LDMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司，4，6二脒基-2-苯吲哚(DAPI)(Sigma公司)，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，CO2恒温培养箱(美国Heraeus公司)，荧光倒置显微镜(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制作 将大鼠随机分成2组:BMMSCs移植组(15只)、培养液注射组(15只)。采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，气管插管连接小动物呼吸机。在心电监护下于胸骨正中纵向切口开胸，打开心包，暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，结扎后即刻可见远端心肌缺血左室前壁心肌变苍白，术后ECG两个或两个以上导联出现J点抬高0.2 mV以上，并持续30 min以上，或新出现的明显Q波表示AMI模型制作成功。术后给予抗生素预防感染。

1.2.2 BMMSCs的分离、培养、标记与移植 取健康Wistar大鼠3只，颈椎脱臼处死，75%的乙醇消毒10 min，无菌条件下分离大鼠股骨及胫骨，从股骨干和胫骨干两端剪断，用磷酸盐(PBS)缓冲液反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块后充分吹打混匀获取细胞悬液。收集细胞悬液并将其转入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入含10%FBS的α-MEM培养液重悬，以1× 106/cm2密度接种于25 cm2的培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。48 h后更换培养液，以后每2～3天换液1次。细胞长到80%～90%融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，收集第4代BMMSCs，将1 mL用L-DMEM培养基配制的DAPI (终浓度为50 mg/L)加入骨髓细胞悬液中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中孵育40 min。PBS反复洗涤6次，除去未残留的DAPI，离心收集细胞，用无血清L-DMEM制成细胞悬液1 mL，含MSCs 1 ×107个，BMMSCs移植组大鼠于心肌梗死后1周再次开胸将0.2 mL BMMSCs共2×106个注射到心梗部位及周围［1］，分5点注射，梗死四周及中央，注射后注射部位局部隆起，颜色变白;培养液注射组开胸后于梗死区中心及周围注射等量的细胞培养液。

1.2.3 左心功能测定 AMI模型制备成功后第4周由同一资深超声技术人员采用超声测量实验鼠的左室收缩末期内径(LVEDs)、左室舒张末期内径(LVEDd)、左室射血分数(LVEF)。

1.2.4 免疫组织化学测定毛细血管密度 完成上述测定后处死大鼠，取出心脏，PBS冲洗，去除左右心房和右心室，垂直于心脏长轴，平行于心脏短轴将心脏组织切成3块，每块组织厚约2 mm，标记清楚后，分别行10%中性甲醛固定、石蜡包埋，然后切片，在荧光显微镜下观察DAPI蓝色标记的阳性供体细胞。镜下计算心肌梗死区毛细血管密度，每张切片随机取10个400倍视野，取平均数作为测定值。

1.2.5 心梗周围非缺血区心肌细胞凋亡TUNEL分析 每个心脏标本的3个组织蜡块各取切片1张，进行TUNEL染色分析。TUNEL阳性反应:细胞核呈棕黄色颗粒者为染色阳性的凋亡细胞，其他细胞核为蓝色。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，数据以s表示，组间两两比较采用t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMMSCs培养的生长情况 原代培养的细胞，接种48 h可见部分细胞已经开始变形贴壁，多呈短梭形或椭圆形，并逐渐呈集落样生长。5～12 d细胞生长迅速，贴壁细胞体积增大，仍呈梭形，有粗大突起伸出，有些细胞则呈三角形或多角形，核居中，有1～2个核仁，出现较大集落样生长，14 d左右细胞生长达80%融合即可传代，以后每3～4天传代一次。传代后细胞形态较为均一，呈梭形。DAPI标记的BMMSCs胞核呈蓝色，标记率达100%，造模后4周可在BMMSCs移植组大鼠心肌梗死区发现大量DAPI标记阳性细胞，胞核呈蓝色。见图1。

图1 BMMSCs移植前后的DAPI标记情况

2.2 两组左心功能指标比较 见表1。

表1 两组左心功能指标比较(s)

表1 两组左心功能指标比较(s)

注:与培养液注射组比较，*P＜0.05

组别 n LVEF(%) LVEDs(mm)LVEDd(mm) BMMSCs移植组 15 46.80±9.20*3.72±0.50* 5.85±0.40*培养液注射组15 33.50±7.60 6.15±0.40 7.25±0.60

2.3 两组毛细血管密度比较 AMI造模后4周，BMMSCs移植组心肌梗死区毛细血管密度为(13.24 ±1.27)个/HP，对照组为(3.45±0.72)个/HP，两组比较P＜0.05。

2.4 心梗周围非缺血区域心肌细胞凋亡TUNEL分析结果 BMMSCs移植组大鼠心肌梗死区域凋亡细胞明显少于培养液注射组。

3 讨论

目前报道的BMMSCs移植方式主要有经静脉移植、经冠脉移植及心内膜下移植［2］。有实验比较了上述3种方式的移植效率，发现经静脉移植组的动物心外器官中滞留的BMMSCs数量显著高于其他两组，移植成功率较低;而冠脉移植组动物心肌梗死区域中BMMSCs的数量则显著高于另外两组，但经冠脉移植组远端血流降低最明显，甚至在无病变区域也出现心肌灌注减少的现象，这可能是因BMMSCs的直径与毛细血管的直径相似，使BMMSCs流经毛细血管时造成阻塞所致。因此，这也可能会在一定程度上削弱经冠脉移植的优势。在本实验中，我们采取经心内膜下注射干细胞的方式进行移植，BMMSCs移植组大鼠心功能明显好于培养液注射组，与有关报道［3］结果相似。考虑可能与心内膜下注射时，BMMSCs可在梗死部位形成干细胞团有关［4］。至于干细胞移植治疗 AMI的最佳移植时机为AMI发生后1～2周［5］，这可能是因为:一方面AMI发生后的最初几天是心肌的损伤修复期，此时损伤的心肌会产生严重的炎症反应，如在此时植入干细胞，其很可能是参与到炎症反应中，而不是参与心肌的再生和血管的形成;另一方面，若移植时间的间隔过长，心肌瘢痕生成过多，则不利于移植细胞在梗死区域的扩散。AMI发生后1周左右，炎症反应明显减轻，同时坏死心肌的周边聚集的大量黏附分子、趋化因子和细胞基质因子是干细胞在心肌损伤区域聚集分化的必要条件。因此，本实验采取在心肌梗死后1周进行干细胞移植。

本试验中，造模4周后行心脏超声检查发现BMMSCs移植组大鼠LVEDs和LVEDd显著降低，LVEF明显增加。处死大鼠后，荧光显微镜下BMMSCs移植组大鼠心肌梗死区可见大量DAPI标记的阳性细胞，同时观察到BMMSCs移植组大鼠梗死区毛细血管密度明显大于培养液注射组，而心肌梗死区域凋亡细胞明显少于培养液注射组。上述观察结果证实，细胞移植后大鼠心脏结构功能的改善与MSCs在心肌梗死局部存活分化为心肌样细胞，减少梗死区心室壁变薄，增加局部收缩功能有关;同时BMMSCs移植组大鼠梗死区毛细血管密度的增加同样证明干细胞除了分化为心肌细胞外，尚可分化为血管内皮细胞，促进损伤局部毛细血管的再生，以增加心肌灌注改善心功能，与Tang等［6］研究结果一致。细胞凋亡是细胞的程序性死亡，是与坏死截然不同的死亡方式。近年研究表明，心肌细胞凋亡是心肌梗死后心力衰竭发生发展过程中非梗死区心肌收缩单位不断丧失的主要原因，心肌细胞的凋亡参与了AMI后心衰的基本病理生理进程［7］。在本研究中，就非梗死区域的心肌细胞凋亡率而言，BMMSCs移植组明显低于培养液注射组。而BMMSCs移植组心梗局部毛细血管密度明显多于培养液注射组，因此推测，心肌细胞调亡的减少与心梗局部毛细血管密度增加有关。

在本实验中，对AMI大鼠经心肌注射BMMSCs达到了预期的结果，但是本实验样本量较小，观察时间较短，有必要增加样本量，延长观察时间，以进一步证实BMMSCs移植在AMI治疗中的安全性及有效性。相信随着更多的基础理论研究以及临床研究的深入，干细胞移植会有更为广阔的研究范围和应用前景。

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