靛玉红对膀胱癌细胞株中Nanog基因表达的影响

曹 婧

郑州铁路职业技术学院,河南郑州 450052

膀胱癌是非常常见的泌尿系统恶性肿瘤，目前我们对膀胱癌采取的主要治疗方法是手术切除，术后化疗，必要时放疗，但疗效不很理想。中药靛玉红是我国创制的治疗慢性粒细胞白血病的有效药物，它的抗肿瘤作用原理主要为抑制DNA聚合酶，影响DNA的聚合过程，从而使DNA合成受抑制。Nanog基因为一与肿瘤干细胞有关的胚胎干细胞转录因子，它能够在诱导干细胞的分化中发挥功能。靛玉红对实体瘤及其相关基因表达的作用还有待研究。由此，该实验将不同浓度的靛玉红作用于人膀胱癌细胞株，并进一步测定其对Nanog基因的表达抑制情况。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

RPMI1640培养液、胎牛血清、甲基四唑蓝、二甲基亚砜（DMSO ）、胰蛋白酶、靛玉红粉剂、EDTA、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、DEPC、DNA marker、 无水乙醇、RNA提取试剂盒，One-step RTPCR试剂盒。人膀胱癌细胞株。

1.2 实验分组

对照组：不加靛玉红；实验组：加入的靛玉红最终浓度分别为 1 μmol/L（A 组）、5 μmol/L （B 组）、10 μmol/L（C 组），传代后培养液内已加入不同浓度的药物。

1.3 细胞培养与处理

RPMI1640培养液中含有10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、链霉素及浓度分别为0、1、5、10μmol/L的靛玉红，膀胱癌细胞株在上述培养液中按常规方法体外培养。每组共3瓶细胞，其中1瓶用于传代，2瓶用于收集。持续传代培养1个月，并收集每组各代细胞，冻存于-40℃冰箱中。

1.4 细胞RNA提取及NanogmRNA的表达检测

用RNA提取试剂盒提取冻存的各组各代细胞RNA，将RNA用one-step RT-PCR试剂盒逆转录为cDNA再进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分析其与内参的灰度比。Nanog 上游引物为 5’-ATG CCT CAC ACG GAG ACTGT-3’，下游 5’-AGG GCT GTC CTG AAT AAG CA-3’，片段长度为66bp；内参 β-actin上游引物 5’-CAT CCT GCG GCT GGA CCT-3’，下游 5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，片段长度为480bp。

1.5 统计方法

采用统计学软件SPSS13.0进行单因素方差分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较用 t检验。

2 结果

结果表明，各实验组细胞对Nanog基因mRNA的表达随靛玉红作用时间的延长逐渐下降。见图1。

选取靛玉红作用9 d为同一观察时相。即对照组和A组传代至第三代细胞，B组为第二代，C组仍为第一代细胞。结果显示，1、5、10μmol/L靛玉红均可抑制Nanog基因mRNA的表达与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），且抑制作用随浓度增加逐渐增强，4组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 不同浓度靛玉红对Nanog mRNA表达影响（±s）

表1 不同浓度靛玉红对Nanog mRNA表达影响（±s）

注：各组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,且4组间表达差异有统计学意义（P<0.05）。

药物浓度（μmol/L） Nanog与内参β-actin灰度比0151 0 0.581±0.017 0.463±0.018 0.212±0.035 0.158±0.041

3 讨论

我国膀胱癌发病率居泌尿系统肿瘤第1位，其中90%以上为移行细胞癌。由于其术后辅助治疗疗效不甚理想，寻找新的、有效的抗膀胱癌细胞增殖的药物已成为当务之急。中药在抗肿瘤方面愈发显出优势，从中药中寻找新的抗肿瘤药物已成为当前的研究热点。靛玉红是从传统中药青黛中提取的有效成分，对慢性粒细胞白血病有明显疗效。其作用原理主要为抑制DNA聚合酶，影响DNA聚合过程，从而使DNA合成受抑制。除此之外，其抗癌作用还可能与提高机体免疫功能有关。目前靛玉红主要用于对慢性粒细胞白血病的治疗，对实体瘤细胞的抑制作用研究进行得较少。

肿瘤干细胞研究目前成为肿瘤细胞生物学的一个热门领域，肿瘤干细胞与肿瘤的发生、进展、复发有密切关系[1]。膀胱癌的复发率较高，与肿瘤干细胞无法被化疗药物杀死，在体内长期存在也有关。探讨干细胞的发生发展及与其有关的基因并寻找通过此途径发挥抗癌作用的药物，已成为肿瘤治疗的新途径，值得进行深入研究。Nanog是新发现的一种转录因子，在保持胚胎干细胞多能性的机制中有重要作用，是具有同源结构域的基因。Nanog在胚胎干细胞即ES细胞有很强的表达，另外，它在胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞中也都有表达。而目前对Nanog的表达调控，尚有待进一步研究。该实验结果表明，Nanog的表达水平在每个实验组内随时间下降。作用时间相同时，Nanog与内参的灰度比随药物浓度上升而逐渐下降。证明靛玉红能够抑制膀胱癌细胞株中Nanog基因的表达，且抑制作用随时间延长和药物浓度增加而增强。这对进一步发掘其抗肿瘤作用机制，开辟其应用的新途径提供了实验和理论依据。

[1]KurisakiA，Hamazaki TS.Chromatin-related proteins in pluripotentmouse embryonic stem cells are downregulated after removal of leukemia inhibitory factor[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，335(3):667-675.