肺孢子菌肺炎实验室诊断方法进展

孟 杰， 陈 辉， 樊子双， 陈晓宁， 田喜凤

(1.承德护理职业学院， 河北 承德 067000 2.河北省承德市医学情报站， 河北 承德 067000 3.承 德 医 学 院， 河北 承德 067000 4.河北联合大学生命科学学院， 河北 唐山 063000)

肺孢子菌(Pneumocystis)是一种机会致病性病原体，于1909年被Chagas首次在豚鼠体内发现的，曾被命名为卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)［1］简称肺孢子虫。随着分子水平的研究，20世纪80年代以后，此虫被更名为肺孢子菌［2］，由其引起的肺炎仍称为肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)。随着AIDS的出现、恶性肿瘤患者放、化疗及器官移植的广泛开展，PCP发病率呈明显上升趋势，引起国内外广泛的关注。本文就PCP的实验室诊断现状展开综述。

1 肺孢子菌生活史

肺孢子菌生活史包括滋养体、囊前期和包囊三个时期。①滋养体:早期呈球形或卵圆形，逐渐变大并呈多态。长径1－5μm。②囊前期:是滋养体与包囊的中间阶段，多为卵圆形，直径4－6μm，主要位于细胞核附近。③包囊:圆形或椭圆形，直径6－7μm，由三层构成，内层为单位膜，中间为电子透明层，最外层为电子致密层。成熟包囊内含有8个囊内小体，少数包囊囊内小体缺失［3］，特别是艾滋病人在经SMZ治疗后，肺孢子菌囊壁破裂或囊壁不完整甚至消失，肺孢子菌可呈现复杂形态。

2 标本采集

2.1 痰液:痰液是检测PC最易获得的标本，而且没有损伤，但临床PCP患者常表现为干咳、少痰和无痰，收集足量痰液标本存在困难，因此检出率很低。为收集到足量痰液，有人采用3%－5%的高渗盐水超声雾化吸入诱导排痰［4］。因痰中常混有大量粘液，可用NaOH 于 37℃水浴消化 0.5－1h后离心，4000－5000转/min，然后取沉淀物涂片染色镜检。尽管其检出率、敏感性高低不一，且临床实际操作及染色过程有待改进，但仍然为目前诊断PCP的安全快速的方法。

2.2 口腔含漱液:当PCP病人痰液标本较少，而超声雾化诱导排痰又要求在特殊房间进行，为防止病原体通过空气播散，Helweg－Larsen［5］等对 28 例 AIDS 合并PCP的患者同时做了口腔含漱液与支气管肺泡灌洗液的检测，经PCR方法检测口腔含漱液敏感性为71%，特异性为100%;支气管肺泡灌洗液的敏感性和特异性分别为96%、100%。因此他们认为口腔含漱液可作为临床标本为PCP的诊断提供依据。

2.3 支气管肺泡灌洗液:支气管肺泡灌洗液是一种通过纤维支气管镜，向肺内灌入无菌生理盐水，反复多次回收灌洗液约10－30mL，经4000转/min离心20min，取沉淀物检查的方法。BALF被广泛应用于细胞学与病原体检查，因此BALF标本检查的阳性率比较高［6］。但BALF操作既要求患者能够耐受，又要求操作人员技术高超，因此通常是在临床患者治疗需要和条件成熟情况下进行的。

2.4 肺组织活检:肺组织活检包括纤维支气管镜组织活检、胸部穿刺和开胸肺组织活检。在病原体检测方面较少采用，因为既对患者身体健康存在较大的危害，又对操作人员技术要求很高。但在必要时还得应用此法，尤其是在动物模型研究方面采用最多［7］，因为肺组织活检标本的检出率最高。

3 诊断方法

3.1 病原学诊断

3.1.1 六亚甲基四胺银染色法(GMS):六亚甲基四胺银染色液主要成分包括六亚甲基四胺与硝酸银，温度稳定在60℃，染色效果会比较好。温度过高，染色液易被氧化变混浊，影响染色效果;温度过低，染色反应会变慢，染色时间长。背景为淡绿色，肺孢子菌包囊，呈圆形或不规则形，囊壁染成黑色或棕褐色，部分包囊可见括弧样结构，或可见核状物及条索状结构，囊内小体不着色［8］。GMS染色法对包囊有特异的染色特性，但不能识别滋养体与囊内小体。是一种简便快捷的染色方法，现在而被广泛应用于肺组织印片的染色。

3.1.2 甲苯胺蓝染色(TBO):甲苯胺蓝染色液主要成分是甲苯胺蓝，是一种人工合成染料。背景为淡蓝色，包囊壁被染成紫红色或深蓝色，镜下包囊呈圆形或椭圆型，囊内小体不着色，滋养体不着色。此法操作快捷，但PC内部结构看不清楚［9］，且易受温度时间因素影响，故现在很少应用此染色法。

3.1.3 吉姆萨染色法(Giesma):吉姆萨染液是由吉氏染粉，甲醇和甘油配成原液，在经磷酸二氢钾与磷酸氢二钠配成的缓冲液进行1:20稀释成为应用染液。方法是将消化离心痰液或BALF经甲醇固定后，滴加吉氏染液，静置30min后油镜下观察，包囊内小体和滋养体被染成紫红色，包囊壁不着色。

3.1.4 瑞一姬氏染液复染法(Wright－Giema’s stain):肺孢子菌的滋养体形状不规则，散在分布或聚集成群。滋养体的细胞核被染成紫红色，细胞质被染成淡蓝色。肺孢子菌的包囊呈圆形或椭圆形，囊壁薄，呈淡蓝色，内含5－8个囊内小体。囊内小体呈块状或新月形，具有紫红色的细胞核和浅蓝色的细胞质。该方法染色步骤简单、时间短，值得在PCP的诊断中推广应用。

3.1.5 荧光染色方法:荧光标记染色液法主要原理为标记了经纯化孢子菌抗体荧光染料，染色时抗体与孢子菌特异结合，利用荧光显微镜观查到荧光物质，进而证明孢子菌的存在。Baselski等［10］使用荧光染色迅速检查出标本中肺孢子菌的包囊。但该检查法所需的荧光显微镜价格昂贵，难易在国内普通实验室推广。

3.2 免疫学诊断

3.2.1 乳胶凝聚试验:在特定条件下将PC抗原与乳胶相连接，使成为颗粒型抗原。这种抗原与PCP患者血清中特异性抗体结合后，形成抗原-抗体复合物，在有适当电解质存在的条件下，经过一定时间，乳胶颗粒即凝聚在一起，显示肉眼可见的凝聚团块，即为阳性反应，否则为阴性反应。

3.2.2 酶联免疫吸附试验:酶联免疫吸附试验(ELISA)包括酶标记抗免疫球蛋白测定抗体法(间接法)和双抗体测定抗原法(夹心法)。正常人血清内普遍存在PC天然抗体，况且PCP一般都是发生在免疫力极其低下或免疫缺陷的病人身上，因此血清抗体的检测对于早期诊断PCP的价值不大。Yasuoka A［11］等学者报道过一种定量检测肺孢子虫抗原标记的血清学方法，称患者血清中肺孢子虫囊壁β－葡聚糖水平明显升高，经治疗后，β－葡聚糖水平也随之下降。

3.2.3 免疫荧光法:包括直接免疫荧光抗体试验(DFA)与间接免疫荧光抗体试验(IFA)。Rigole［12］比较了DFA和Giemsa、GMS染色的区别，认为DFA是可信赖的高敏感性和高特异性的方法;Chatterton等使用鼠源性抗原，特别是滋养体抗原，用IFA检测血清中的PC IgG、IgM、IgA，结果表明，IFA是检测血清PC IgG最有效的试验［13］。此外，Arasteh等研究认为 IFA是诊断HIV阳性患者是否合并PCP的最恰当方法［14］。

3.3 分子生物学诊断

表1 常用引物名称与碱基序列

3.3.1 聚合酶链反应:聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的基本原理是:在人工合成的上、下游各一条由20－30个核苷酸组成的序列特异引物的引导下，以靶DNA为模板，通过变性和退火处理，在DNA聚合酶的作用下，以单核苷酸为原料合成一对引物之间的DNA片段。引物的质量是PCR方法成败的关键环节之一。以诊断为目的的PCR反应，一般应选择待检测病原体具有特异性的DNA序列。引物序列可人工设计，或用计算机软件辅助设计。引物设计应遵循具有靶DNA序列特异性、G+C含量适当、引物序列内无二级结构形成、一对引物间无互补序列等基本原则。自wakefield等［15］1990年首次报道应用PCR技术检测肺孢子虫以来，由于其具有无创、和很高的阳性率及敏感性，而逐步得到广泛研究。综合目前文献，PCR检测PC DNA常用的引物名称与碱基序列见表1。

陈盛霞等［16］以 PAZl02E、PAZl02H 为引物，采用PCR检测PCP大鼠支气管肺泡灌洗液PC并与传统Giesma病原染色法相比较，认为其检出率较后者高。Nuchprayoon S等学者［17］采用PCR技术检测免疫功能受累者是否并发PCP，认为其可作为早期诊断PCP的实验室方法。

巢氏PCR即采用两对引物的两步PCR，张小娟等学者［18］经研究认为巢氏PCR比普通PCR具有更高的敏感性和特异性。在第1对引物引导的扩增反应结束后，第2对引物结合在第1次PCR产物内部进行第2轮扩增，这使得如果第1次扩增产生了错误片断，则第2次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，进一步保证了结果的可靠性。

Real－time PCR即荧光定时定量PCR，于1966年发明。Real－time PCR技术是将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，对未知模板进行定量分析。与常规PCR相比，其灵敏性与特异性均更高、更强。目前已广泛应用于医学研究领域。

3.3.2 核酸探针技术:核酸探针技术，又称DNA分子杂交技术，也是以两条互补的DNA链的变性和复性反应为基础，其中一条链为目的DNA链，另一条为标记有指示物的探针链。这样，通过一定方式检测指示物的存在与否，就可获知标本中目的DNA的有无。

作为探针的 DNA有多种类型，可源自基因组DNA，也可用基因重组法制备，或是人工合成的寡核苷酸。当获得DNA模板后，即对他们进行指示物的标记，标记物可以是放射性物质，也可是生物素、地高辛等非放射性物质。不同的标记物要求相应的显示方法。用放射性核素标记的探针，需用放射自显影曝光在X线片上;生物素标记探针可通过ABC系统以酶反应显色底物指示;地高辛标记探针则是用酶标抗地高辛抗体结合地高辛后，最终也是以显色底物指示。

核酸分子杂交的主要方法包括Southern杂交、斑点杂交、Northern 杂交和原位杂交等。Hayashi［19］等以PC rRNA作为分子杂交的靶核酸，设计合成与之互补的生物素化的寡核苷酸探针用于原位杂交，来检测患者肺组织中的肺孢子菌，结果其敏感性与特异性都较高，是传统染色法的有力补充。此后Graves［20］等学者用狭缝杂交检测肺孢子菌也很敏感。

总之，目前，肺孢子菌肺炎的实验室诊断方法包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断三种方法。比较各种检测肺孢子菌的检查手段，病原学染色法敏感性最低，检出率比较低;血清抗体检测因健康人群普遍携带PC抗体而无临床诊断价值;PCR方法的敏感性最高，能补充传统染色和免疫组化法，有助于PCP的早期诊断，同时，也为PC的分子水平研究提供了一种有效的手段。但是，PCR检测技术可能受到实验室环境与操作者经验的影响，可能出现假阳性结果，需要临床医生根据病人的临床表现、胸部X线、血气分析及肺功能测定等多方面资料来诊断和治疗PCP。随着分子生物学诊断技术的不断完善，PCR检测技术将对肺孢子菌肺炎的诊断与预防等方面起着积极重要的作用。

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