苦参愈伤组织诱导及继代培养条件研究

刘 瑶， 齐香君， 李 雅， 李 军

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院，陕西 西安 710021; 2.中国药科大学 国际医药商学院，江苏 南京 211198)

0 引言

中药苦参(SophoraflavescensAit.)为豆科槐属落叶灌木植物，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功能.苦参中的苦参碱和氧化苦参碱具有良好的抗癌活性，对黑膀胱癌、色素瘤、胃癌等均有抑制作用[1].目前以苦参和其有效成分为原料开发了多种制剂并广泛用于临床[2].随着苦参制剂的开发，苦参药材的市场需求量在不断增加，2011年苦参市场价14元左右，在近几年内翻了4倍多.本研究旨在从中药资源可持续性发展考虑，对苦参愈伤组织诱导及继代培养条件进行研究，为药用植物苦参资源的可持续发展探索新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂

苦参种子购买于河北安国药材市场；乙腈(分析纯)、无水乙醇(分析纯)购于天津市红岩化学试剂厂；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)植物激素均购于天津市科密欧化学试剂开发中心.MS培养基：Murashige and Skoog(1962)培养基.

1.1.2仪器设备

高效液相色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪；培养箱：LRH-250-GSI智能人工气候箱.

1.2 方法

1.2.1苦参外植体制备

选颗粒饱满苦参种子，直接种植土壤中，室温发芽；或将种子做常规消毒处理[3]后接于MS培养基种，25±1℃，黑暗条件下发芽，培养一周左右后获得苦参幼芽；光照条件下继续生长两星期获得苦参幼苗.

1.2.2不同外植体对苦参愈伤组织诱导的影响

为了考察苦参愈伤组织诱导的最佳外植体，分别取苦参幼苗叶片、根、茎和苦参幼芽为外植体，叶片切成0.5～1.0cm2大小的方块，根、茎和幼芽切成1.0～1.5cm小段，接种于MS+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA培养基中，25±1℃，暗条件下诱导培养.

1.2.3植物激素组合对苦参愈伤组织诱导的影响

激素组合对愈伤组织的诱导率、颜色、质地、生长状态等影响较大.本研究以苦参幼芽为外植体，将其接种于不同植物激素组合的MS固体培养基上，25±1℃，黑暗条件下诱导培养，观察不同激素组合下苦参愈伤组织诱导情况.

1.2.4苦参愈伤组织增殖继代培养研究

为了考察苦参愈伤组织增殖的最佳激素组合，以苦参愈伤组织生物量的增殖率为测定指标，将诱导出的颜色、质地、形态都相似的愈伤组织，设计L9(34)正交试验，25±1℃，黑暗条件下考察不同激素组合对苦参愈伤组织生长的影响，每组设3个平行(n=3).

1.2.5愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱的检测

HPLC检测苦参碱(MT)及氧化苦参碱(OMT)的色谱条件：色谱柱：氨基柱(Hypersil NH24.6mm×250mm，5μm，柱号：E2021505，批号：9347)；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84∶8∶8)；检测波长：220nm；流速：1mL/min；进样量：15μL；柱温：室温.

2 结果与分析

2.1 不同外植体对苦参愈伤组织诱导的影响

以苦参幼芽、幼苗的根、茎段、叶片为外植体，在MS+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA培养基中，25±1℃，暗条件下苦参愈伤组织的诱导率分别为94.12%、74.19%、35.71%、23.08%.幼芽为其诱导的最佳外植体.以幼芽为外植体其愈伤组织的诱导率最高.诱导过程中，苦参幼芽在培养基上接种7d后，伤口开始膨大，待诱导至10d左右，伤口的膨大部位逐渐长出淡黄色的愈伤组织(如图1所示)，继续培养，愈伤组织逐渐长大.

图1 以幼芽为外植体诱导的愈伤组织

2.2 植物激素组合对苦参愈伤组织诱导的影响

不同植物激素对苦参愈伤组织诱导的影响结果如表1所示.

表1 激素组合对苦参愈伤组织诱导的影响

从表1中可以看出，不同植物激素组合均能诱导出愈伤组织.在MS+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA组合下其诱导率最高，为94.12%.在不同激素组合下，苦参愈伤组织形态没有明显差异，呈淡黄色，质地松软.

2.3 愈伤组织的继代培养研究

不同植物激素组合下苦参愈伤组织的继代增殖结果如表2所示.

表2 正交试验结果

由直观分析可以看出，苦参愈伤组织增殖率的最优激素组合为A2B1C2，其增殖率为23.8%.所选3个因素对苦参愈伤组织增殖率影响的强弱顺序为C>A>B；其增殖的最佳激素组合为A2B2C2，组合不在正交表试验里，需做验证性试验.由试验结果看，A2B2C2组合下愈伤组织的增殖率为25.3%(大于23.8%)，颜色透亮，呈淡黄色，质地松软，生长较快(如图2所示).

表3 方差分析结果

注：F0.95(2,2)=19.

由方差分析结果(如表3所示)可以看出：因子C(NAA)在α=0.05水平上对苦参愈伤组织增殖具有显著性影响.

图2 愈伤组织增殖前后对比

2.4 愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱的检测

本研究采用HPLC法对苦参愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱进行定量分析，其苦参碱(MT)及氧化苦参碱(OMT)的积累情况如表4所示.

表4 愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱的含量

由结果可知，苦参愈伤组织中氧化苦参碱的含量较高，苦参碱及氧化苦参碱的总含量为4.74%，是《中华人民共和国药典》2010版[4]中规定二者含量不低于1.2%的3.95倍.这可能与诱导苦参愈伤组织的外植体(幼芽)有关系，由检测结果可知，幼芽中氧化苦参碱的含量较高，使得愈伤组织中氧化苦参碱的含量也处于较高水平.

3 结束语

(1)不同外植体下，苦参愈伤组织诱导率不同.以苦参幼芽、幼苗的根、茎段、叶片为外植体，其愈伤组织的诱导率分别为94.12%、74.19%、35.71%、23.08%.幼芽为其诱导的最佳外植体.

(2)苦参愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/LNAA，25±1℃，黑暗条件；增殖培养基的最佳激素组合：MS+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA，25±1℃，黑暗条件；此条件下其增殖率为25.3%.

(3)苦参愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱的总含量为4.74%.

[1] 何 雄，韦星船，田裕昌，等．苦参碱及其衍生物合成及生物活性研究进展[J]．中国现代应用药学，2011，28(9)：816-823.

[2] 张凤玲，唐 永，张景梅．苦参碱、氧化苦参碱的药理作用及其制剂的研究进展[J]．河南中医学院学报，2004(3)：84-86.

[3] 齐香君，陈秀清，何恩铭.发根农杆菌诱导黄芩毛状根的研究[J]．西北农业学报，2006，15(5)：244-247.

[4] 中华人民共和国药典委员会.中国药典一部[M]．北京：化学工业出版社，2010.