姜黄素体外抑制淋球菌活性的研究

夏承来 黄汉辉 何之广

广州医学院第三附属医院药剂科，广东广州 510150

性传播疾病，是以性接触为主要传播方式的一组疾病。国际上将20多种通过性行为或类似性行为引起的感染性疾病列入生殖感染范畴。淋病是目前世界上发病人数最多的生殖器感染之一，由淋球菌引起，男性较女性多见。得淋病后，主要症状是尿道炎，尿道口红肿、流脓、有刺痛、灼热感，排尿困难，小便次数多。若不及时治疗会转成慢性尿道炎。目前防治淋病的主要方法有：使用避孕套、减少性伴以及运用抗菌素治疗生殖道感染[1]。由于细菌对青霉素类药物的耐药性不断增加，开发新的抗淋球菌药物已经迫在眉睫。

姜黄为姜科姜黄属的多年生草本植物，根茎发达，成丛，分枝呈椭圆形或圆柱状，具有良好的药用价值和经济前景。从其根茎中提取的活性成分主要为姜黄素。研究发现姜黄素具有抗氧化、抗炎、抑癌作用以及对多种蛋白激酶有抑制活性[2]。且有研究表明，在淋球菌导致的机体炎症反应中，姜黄素可以阻断NF-kappaB信号通路来抑制TNF-α、IL-6和IL-8等炎性因子的释放[3]。但是目前并无姜黄素直接抑制淋球菌的生长的报道。为此本资料中主要研究了姜黄素体外抑制淋球菌的活性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞和淋球菌菌株来源

原代培养的包皮角朊细胞购自武汉非典型物收藏中心。从临床标本中分离获得淋球菌菌株，经形态学染色、氧化酶试验、生长鉴定和糖发酵试验鉴定。用接种环挑取培养18 h的新鲜菌液，洗于含无菌生理盐水2 mL的小试管中，调整细菌数至2 MacFarland单位（4×108/mL）。

1.2 姜黄素细胞毒性的测定[4]

姜黄，市售。姜黄素的提取工艺条件: 将姜黄置于6倍其量的70%乙醇溶液中，回流提取3次，每次1.5 h。

3,3’-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠（XTT）购自sigma公司。XTT检测方法：（1）XTT储存液的配置：用PBS将3,3-bis[1-methoxy-3,4-nitro-5-sulophenyl]-2-[4-(phenylamino) carbonyl]-6-tetrazolimhydroxide（XTT）配成1 mg/mL；（2）聚α-甲基苯乙烯（PMS）储存液的配置（100 X）：用磷酸缓冲液（phosphate belanced solution，PBS）将 N-methylphenazonium methosulfate（PMS，MW=306.3）配成2 mM（0.612 mg/mL），分装后保存在-20℃条件下；（3）XTT工作液的配置：将100μL PMS储存液（100X）和9.9 m L XTT储存液混合而成，PMS的终浓度为0.02 mM；（4）加入50μL XTT/PMS工作液，37℃孵育4 h后用多功能酶标仪检测OD450的吸光值并计算细胞毒性率和CC50值。

1.3 姜黄素抑菌圈的测定[5]

采用平板（打孔法），待MHSM平板干后，用无菌棉签蘸取菌液，在培养基平板上密集画线接种。盖好平皿，放置5 min，待平板表面水分吸收后，用直径6 mm无菌金属打孔器在平皿内打孔，除去洞内琼脂，用微量移液器吸取50μL不同浓度的药液，依次加入洞内，37℃培养16~18 h，记录抑菌圈的直径，实验重复3次，3次平均值为化合物的抑菌直径。

1.4 姜黄素最低抑菌浓度（M inimal inhibitory concentration，M IC）的测定

根据文献[5]，采用平板稀释法，于直径9 cm灭菌培养皿中分别加入无菌溶剂配成的不同浓度姜黄素（200 mg/mL，100 mg/mL，50 mg/m L，25 mg/mL，12.5 mg/m L，6.25 mg/m L，3.13 mg/mL 和0 mg/mL）1 mL，然后注入已经融化的冷却至45℃的淋球菌琼脂培养液9 m L，立即旋转混匀，凝固。用接种环挑取一满环菌液，划线接种于平板上，同时在不含药液的平板上，接种相同量的菌液为对照，置于置淋球菌最佳培养温度条件下培养1个周期，于培养皿中分观察并记录菌落数。其中每个浓度做 3个平行皿，以无菌生理盐水为空白对照。以不长菌的药物最高稀释度为该化合物对淋球菌的最低抑菌浓度（实验重复3次，取3次或2次相同者为报告数据）。

表1 姜黄素对淋球菌的抑菌作用 (37℃培养24 h )

表2 姜黄素对淋球菌的最低抑菌浓度（37 ℃培养24 h）

2 结果

2.1 姜黄素对原代培养的包皮角朊细胞的细胞毒性

96孔板每孔铺原代培养的包皮角朊细胞（每孔细胞浓度为10 000个/m L）和不同浓度的姜黄素（400 mg/m L，200 mg/mL， 100 mg/mL，50 mg/m L，25 mg/m L 和 0 mg/m L）37℃孵育过夜；去除150 μL培养基后再加入150 μL新鲜培养基，再于37℃孵育72 h；加入50μL XTT/PMS工作液，37℃孵育4 h后用多功能酶标仪检测OD450的吸光值并计算CC50值。姜黄素对原代培养的包皮角朊细胞的细胞毒性的CC50值＞（400.00±1.16）mg/mL。见图 1。

图1 姜黄素对原代培养的包皮角朊细胞的细胞毒性

2.2 姜黄素对淋球菌的抑菌圈

200 mg/mL的姜黄素对淋球菌有抑菌圈产生，说明其对淋球菌有明显抑杀作用，与最小抑菌浓度试验结果亦相符。考虑到纸片直径为5.0 mm，因此认为抑菌环直径＞7.0 mm时，姜黄素有抑菌作用；抑菌圈≤7.0 mm时，姜黄素无抑菌作用。见表1。

2.3 姜黄素最低抑菌浓度

用菌体生长面积占平板面积的百分比来表示姜黄素对淋球菌的抑菌作用。当姜黄素浓度低于100 mg/mL时，菌体生长面积占平板面积的百分比逐渐增加，说明低于100 mg/mL的姜黄素对淋球菌不再具有完全抑制作用。因此，姜黄素必须达到一定浓度后对淋球菌有抑制作用，其最小抑菌浓度是100 mg/mL。见表2。

3 讨论

20世纪40年代中期，青霉素成为治疗淋病的首选药物。随着青霉素的广泛应用，淋球菌对青霉素出现低水平耐药，此后耐药程度渐增[6]。淋球菌耐药菌株在某一地区产生后，可迅速在局部、一个国家内及不同国家间传播。美国疾病控制中心在《性传播疾病治疗指南》中不再推荐青霉素与四环素作为治疗淋病的首选药物。最近的全球淋球菌耐药监测结果发现[7-8]，淋球菌对氟喹诺酮类药物、第三代头孢菌素的敏感性也出现下降或耐药，淋球菌耐药已成为当前淋病防治中棘手的问题。我国淋球菌耐药监测资料表明，淋球菌对青霉素和四环素耐药较为普遍，许多城市和地区检出产青霉素酶淋球菌，其中检出阳性率以成都、重庆为高，上海和南京地区耐药菌检出率也呈上升趋势，青霉素和四环素已不宜用于治疗淋病。因此，寻找新的抗淋球菌药物已经刻不容缓。并且随着社会的发展，人们越来越关注化学药品给人类自身健康及生活环境带来的负面影响；回归自然、保护环境已成为一种处理人类和环境关系的潮流思想。近年来，由于天然药物在治疗上的独特优势（来自大自然，毒副作用小，在治疗艾滋病等疑难杂症上有广阔的前景）而倍受重视[9-10]。

因此本资料关注了来源于姜黄的提取物姜黄素的抗淋球菌的活性，结果表明，200 mg/mL的姜黄素对淋球菌有抑菌圈产生，抑菌圈的直径是（14.3±1.3）mm；同时，姜黄素达到一定浓度后对淋球菌有抑制作用，其最小抑菌浓度是100 mg/mL，说明姜黄素能够抑制淋球菌的生长。但是姜黄素是否可以开发成新的抗淋球菌药物用于临床研究，还需要大规模的实验来证实。

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