新能量状态下抗肿瘤光敏剂的研究

李 翀，卓先勤

(1三亚市人民医院重症医学科，海南三亚572000;2琼州学院理工学院，海南三亚572022)

0 引言

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)对肿瘤杀伤作用的基础研究，近年来引起人们的高度重视.Survivin是近年新发现的一种肿瘤特异性凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，具有抑制凋亡效应蛋白酶caspase活性、参与细胞周期调控及调节细胞有丝分裂等多种生物学作用，与肿瘤的发生发展密切相关［1］.

在假定新能量状态下光敏剂为有重大潜力光敏剂的基础上，探讨了新能量状态下光敏剂产生单线态氧的能力及其产生的单线态氧对肿瘤细胞的杀伤能力，旨在为新能量状态下光敏剂光敏剂的开发提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 新能量状态下光敏剂

以文献［2，3］的方法制备溶于5%二氯甲烷的甲醇溶液成1mg/ml新能量状态下光敏剂储液.

1.2 NADPH磷酸盐重水缓冲液的配制［4］

将样品配成2 mg/ml的二甲基亚砜溶液.称取0.626gNa2HPO2·12H2O和0.0314gKH2PO4溶于适量水中，使总体积为100ml，即得pH7.4－7.8的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液.称取33.25 mg还原型辅酶Ⅱ钠盐加入上述磷酸盐重水缓冲液，即为0.4 mmol/L NADPH磷酸盐重水缓冲液.

1.3 新能量状态下光敏剂在重水中对NADPH氧化作用的光动力敏化效应

将新能量状态下光敏剂与适量NADPH磷酸盐缓冲液混匀，使样品浓度分别为1、2、3、4、5μmol/L，光源由高压汞灯加滤光片(800 nm)获得，然后在紫外分光光度计上于波长340 nm测定辐照后样品溶液中NADPH残留量.用同样照光的不含NADPH而含等量同浓度样品的磷酸盐缓冲液作空白，以照光的不含样品而含等量水的NADPH缓冲液作对照，测定各个样品于不同浓度下NADPH剩余百分率，取3次测定的平均值，结果见表1.

1.4 细胞培养

用RPMI 1640(胎牛血清FCS含量10%)培养基培养传代的肿瘤细胞，在细胞达指数相增长后，通过二倍稀释法取一定量的细胞培养液，使用血细胞记数板确定细胞的浓度.

1.5 新能量状态下光敏剂中新能量状态下光敏剂浓度参数的探讨

将新能量状态下光敏剂储液用5%二氯甲烷的甲醇溶液依次稀释成20、10、5、3、1 μg/ml，作为新能量状态下光敏剂参考浓度.

对肿瘤细胞进行新能量状态下光敏剂－PDT处理的同时，以单纯光照组、单纯新能量状态下光敏剂组为处理组的对照，并以未处理的细胞为空白对照.取密度为1×105个/ml的细胞，分别接种于96孔细胞培养板，每孔98 μl细胞液加入2 μl对应浓度得新能量状态下光敏剂溶液，每一浓度设5个复孔，在CO2培养箱中暗作用3 h后，到光反应室照光50 min，继续培养至24 h，每孔加入20 μl MTT，继续于CO2培养箱中暗作用4 h后，轻轻吸取上清70 μl，加入DMSO 150 μl，混匀，至甲溶液中溶解，于酶联检测仪上测定各孔的OD490值.计算细胞的存活率:

细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%.

每孔重复计数3次取平均值.

2 结果与讨论

2.1 D2O中新能量状态下光敏剂对NADPH的光动力敏化效应

表1 锌菌绿素在D2O中对NADPH光氧化作用的敏化效应

由表1可见，锌菌绿素在重水中对NADPH具有较强的光氧化作用，在10 μg·ml－1时可以使90%以上的NADPH发生光氧化作用，提示锌菌绿素具有较强的单线态氧产率.

2.2 不同新能量状态下光敏剂浓度对肿瘤细胞存活率的影响

图1 不同新能量状态下光敏剂浓度对肿瘤细胞存活率的影响

由图1可知，随着新能量状态下光敏剂浓度的增加，肿瘤细胞存活率呈明显的下降趋势.当新能量状态下光敏剂浓度为10 μg/ml和20 μg/ml，肿瘤细胞的存活率分别为5.7%和5.2%，两者之间无显著差异.

3 讨论

光动力疗法治疗肿瘤，临床上已证实有确切疗效，但其作用机理尚未完全阐明.一般认为，PDT主要通过一下三方面机制而达到治疗肿瘤的作用［5］:(1)直接杀死肿瘤细胞，(2)破坏肿瘤组织内的血管，(3)免疫调节作用.如中国医学科学院肿瘤研究所周传农［6］研究员的课题组经十多年努力，认为光动力作用主要是通过微血管内皮细胞损伤和微循环障碍引起局部缺血、缺氧，导致肿瘤细胞的继发死亡.

PDT是一种高选择性肿瘤治疗方法，通过光敏剂在肿瘤细胞中聚积，受光照后产生氧自由基达到杀死肿瘤细胞的目的，它具有毒性低，易重复治疗等优点，氧化损伤是其主要的治疗机制.但体内试验中发现其机制远较单纯氧化损伤复杂，血管损害、凋亡等多种因素均参与其中.从研究中可以看出，锌菌绿素具有高单线态氧产率并对肿瘤细胞具有高杀伤，提示单线态氧对细胞的杀伤作用在PDT机理中具有重要地位.

［1］许德余.光动力治癌药物的历史、现状、进展、问题和前景［J］.中国激光医学杂志，2009，10(1):44～47.

［2］王梦亮，常如波，刘滇生.金属细菌叶绿素的合成及其抗肿瘤活性研究［J］.药学学报，2005，40(10):920－923.

［3］M.Wendling，K.Lapouge，F.van Mourik，et al.Steady－state spectroscopy of zinc－bacteriopheophytin containing LH1 － an in vitro and in silico study.Chem.Phys，2011，275:31 －45.

［4］方勇，许德余，刘建飞.卟啉还原合成二氢卟吩及其光生物活性研究［J］.中国激光医学杂志，2010，10(2):82－85.

［5］Kristjan Plaetzer，Tobias Kiesslich，Thomas Verbare and so on.The Modes of Cell Death Induced by PDT:An Overview［J］.Med.Laser.Appl，2003，18:7 －19.

［6］周传农.国外光动力疗法新进展——国际光动力学会第九届年会简介［J］.中国激光医学杂志，2003，12(4):262－264.