阿特拉津高效降解菌株的筛选和降解特性研究*

朱 静,李铁晶

（东北农业大学 食品学院，黑龙江 哈尔滨 150080）

阿特拉津,商品名莠去津，英文名Atrazine（ATZ），化学名称:2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪。作为一种三嗪类除草剂，阿特拉津成本低且除草效果好，在世界范围内得到了广泛应用[1]。由于多年的大量使用，残留期长，形成了对土壤、水体等自然媒介的污染，在环境水体中检出率较高[2，3]。目前，阿特拉津已经被认定为内分泌干扰物质（EDCs）[4]。

针对阿特拉津造成的污染问题，许多物理和化学去除方法被提出[5-7]，但去除效果都不尽理想，且生成的副产物不仅毒性大且更易扩散和渗透，造成水体的污染，生物降解具有成本低、效率高、无二次污染等诸多优点。目前，已报道的阿特拉津降解微生物主要以细菌为主也分离到少量真菌、放线菌和藻类等[8]。

本研究利用富集培养法，从污水处理场的污泥中分离得到1株阿特拉津高效降解菌株。对其进行菌种鉴定并对其降解特性进行研究，以期今后对该降解菌株做进一步的研究及ATZ污染水体的生物修复应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Waterse2695高效液相色谱仪-2998紫外检测器（美国Waters公司）；HITACHI扫描电子显微镜；HZQ-FX恒温震荡培养箱（东联电子公司）；HVE-50高压灭菌锅（HIRAYAMA）等。

1.2 培养基

标准阿特拉津液体培养基（g·L-1）：KH2PO40.9，Na2HPO4·12H2O 6.5，MgSO4·7H2O 0.2，萄萄糖 3.0，阿特拉津0.5（氮源，配成10g·L-1甲醇储液，高压灭菌之前加入）。

LB 培养基（g·L-1）:蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，蒸馏水定容至1L。

1.3 色谱分析条件

阿特拉津浓度采用高效液相色谱法测定。色谱柱为 4.6×250mm，5μm反相 C18柱;柱温 25℃;以乙腈和水做为流动相，体积比为40∶60，流速为lmL·min-1；检测器检测波长为200nm；进样量10μL。

1.4 降解菌株的分离与筛选

采用富集培养法，梯度驯化方式，取250mL三角瓶，装50mL阿特拉津液体培养基，接种5mL污泥混合液30℃，150r·min-1振荡培养。5d后取5mL培养液于50mL新培养基中，阿特拉津浓度增加到200mg·L-1重复上述步骤，每次阿特拉津浓度增加100mg·L-1，至终浓度 500mg·L-1。

1.5 16S rRNA基因PCR扩增和测序

用PCR方法，以L-1菌株的总DNA为模板，扩增16SrRNA基因，产物检测后回收纯化，与pMD19-T载体连接，转化E.coliDH5α。重组质粒由北京鼎国生物公司进行测序。用GenBank数据库进行菌株的16S rRNA基因序列Blast比对，搜索同源性最高的相关序列，进行进化树作图，确定菌株L-1分类。

2 试验结果

2.1 阿特拉津降解菌株的分离

通过富集培养，从城市污水处理厂的污泥混合物中分离和筛选出一株能够降解除草剂阿特拉津的降解菌株，命名为L-1。该降解菌株能够利用阿特拉津作为唯一氮源进行生长。

2.2 降解菌株的鉴定

菌株L-1葡萄糖发酵、明胶液化和接触酶反应阳性，淀粉水解、甲基红（M.R）、V-P、氧化酶反应为阴性。于LB培养基培养约24和72h后发现，24h的幼龄细胞呈现短杆状见图1。

图1 幼龄细胞扫描电子显微镜图（×10000）Fig.1 Scanning electron micrograph of L-1 young cells

72h的老龄菌体细胞呈现圆球形见图2。表明L-1菌株细胞存在明显的杆球变化特征。

图2 老龄细胞扫描电子显微镜图（×10000）Fig.2 Scanning electron micrograph of L-1 aging cells

将降解菌L-1的16S rRNA基因序列提交GenBank数据库，获得登录号为FJ378034，对该序列进行Blast比对，结果显示与多个节杆菌属（Arthrobacter sp.）细菌的16S rRNA基因同源性在99%以上。结合菌株形态和生理生化特征，鉴定该菌株为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。

图3 菌株L-1的16S rRNA基因系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rRNA genes of strain and other related strains

2.3 降解菌生长曲线和降解曲线

图4 L-1菌株的生长（a）的阿特拉津降解曲线（b）Fig.4 Curves of growth（a）and atrazine degradation（b）of strain L-1

由图4菌株生长和降解曲线可见，L-1菌株的对数生长期为24～60h，此后进入稳定期。在前12h时阿特拉津的利用率很低，进入对数生长期后降解速度开始迅速加快，96h阿特拉津的降解率达到94.8%，降解效果理想。

2.4 温度对降解的影响

在不同温度下，考察菌株L-1对阿特拉津的降解效果。结果发现L-1菌株在15～30℃条件下随着温度的升高，降解率随之增大。在30℃达到最大降解率约92.8%后，当温度继续增加，降解率急速下降。当温度为40℃时仅为21.2%，表明该菌株不能耐受较高温度，这与很多节杆菌属（Arthrobacter sp.）细菌类似。

图5 温度对阿特拉津降解率的影响Fig.5 Effect of temperature on atrazine biodegradation

2.5 pH值对降解的影响

不同的初始pH值对降解效果的考查发现，菌株L-1在pH值为6时降解效率理想，降解效率为82.2%，说明L-1菌株能适应一定的弱酸环境；在pH7～8范围内，降解率达到最大，96h的最大降解率为94%左右；当pH＞8时，随着pH的逐渐升高，降解率随之减少，至pH值为10时，降解效率只有45%左右；因此，L-1菌株的最佳pH值范围为7～8。

图6 pH值对阿特拉津降解率的影响Fig.6 Effect of pH on atrazine biodegradation rate

3 结论

（1）通过富集培养法，从污水处理场的污泥中分离得到1株阿特拉津高效降解菌株，命名为L-1。通过菌体形态观察并结合生理生化反应及16S rRNA鉴定，判断该菌为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。

（2）将L-1接种于500mg·L-1的阿特拉津无机盐培养基，96h对阿特拉津的降解率达到94.8%，降解效果理想。通过室内降解效果优化试验，确定菌株L-1对阿特拉津最佳降解条件:温度为30℃，初始pH值范围为7～8。

［1］Luciane S，Attilio C.2010.New aspects on atrazine biodegradation［J］.Brazilian Archives of Biology and Techonlogy，2010，53（2）:487-496.

［2］Freitas LG，Singer H，Müller S R，et al.Source area effects onherbicide losses tosurface waters-A case studyin the Swiss Plateau［J］.Agriculture，Ecosystems&Environment，2008，128（11）:177-184.

［3］吴卫东，周驰.高压液相色谱测定地表水和饮用水中的阿特拉津［J］.干旱环境监测，2011，25（1）:1-8.

［4］Guérit I，Bocquené G，James A，et al.Environmental risk assessment:A critical approach of the European TGD in an in situ application［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，71（9）:291-300.

［5］乐驰，庄惠生.胶图强化超滤处理水中阿特拉津的研究［J］.干旱环境监测，2011，25（2）:65-69.

［6］李绍峰，梁媛，张荣全，等.O3/H2O2降解Atrazine效能研究［J］.环境科学，2009，30（5）:1425-1429.

［7］Hiroshi A，Toshihiko M.Experimental study of behavior of endocrine-disrupting chemicals in leachate treatment process and evaluation of removal efficiency［J］.Waste Management，2009，29:1852-1859.

［8］万年升，顾继东，段舜山.莠去津生态毒性与生物降解的研究［J］.环境科学学报，2006，26（4）:552-560.