培养人眼小梁细胞水通道蛋白1与细胞外基质的相关实验研究

彭 洁，张 虹

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院眼科，四川 成都 610072;2华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，湖北 武汉 430030)

细胞外基质是房水流出小梁网排出系统时的主要阻力。房水流出通道组织中细胞外基质异常沉积，将导致细胞间、细胞与基质间连接紧密，细胞骨架结构稳定、僵硬，同时沉积的细胞外基质堵塞小梁网，尤其阻塞Schlemm管的邻管小梁网组织，使房水流出阻力增加，出现病理性眼内压升高［1～3］。我们前期实验中地塞米松(dexamethasone，DEX)能诱导小梁细胞水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP1)表达改变［4］。DEX能使小梁网系统的细胞外基质分泌变化也已被多项研究证实［2，5］，那么该过程中，是否同时有AQP1参与，2010年6月至2011年12月本实验就此作了初步探讨，以揭示AQP1在小梁细胞上生理功能的相关机制。

1 材料与方法

1.1 人眼小梁组织 人眼小梁组织来源于意外死亡且无眼部疾患者，均于身故24小时内取材。该研究项目经四川省医学科学院·四川省人民医院伦理委员会批准，患者家属详知实验目的和研究方案，均签署了由该院伦理委员会批准的患者知情同意书。

1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司)，胎牛血清(美国HYCLONE公司)，兔抗人AQP1多克隆抗体(美国CHEMICON公司)，兔抗人神经原特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗体，兔抗人纤维连接蛋白(fibronectin，FN)多克隆抗体，鼠抗人层粘连蛋白(laminin，LN)单克隆抗体，鼠抗人胶原蛋白 I(collagen I，CAI)单克隆抗体、鼠抗人胶原蛋白IV(collagen IV，CAIV)单克隆抗体、FITC荧光羊抗兔二抗，免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，AQP1反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODN)(北京赛百盛公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 人眼小梁细胞培养及鉴定 于无菌条件下，在角膜缘后5 mm处环形剪开眼球，去除玻璃体、晶状体及葡萄膜，手术显微镜下找到小梁网，用眼科镊顺其方向撕下海绵状小梁网，角巩膜交界处可见位置很浅的巩膜内沟。将小梁网剪成细小碎块，接种于培养瓶或6孔培养板，置于含20%胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养。原代培养采用3或4只眼的小梁组织。待融合后以胰蛋白酶消化、传代培养，取传3代细胞，于光学显微镜下观察细胞形态，免疫组织化学法检测NSE、FN、LN、CAI、CAIV等人眼小梁细胞特异性标记，鉴定人眼小梁细胞。

1.3.2 实验分组与处理 DEX(美国SIGMA公司)用50%乙醇溶解，继以DMEM/F12稀释，除菌过滤后存于4℃冰箱备用，所含乙醇的最终浓度不超过0.05%，不影响细胞的分裂增殖。AQP1AS-ODN，5'-CAGCCCTCCAGAAGAGCTTCTTCTT-3'，用来减少培养小梁细胞AQP1的表达，5'端头9个碱基和3'端尾7个碱基被硫化修饰。传三代的细胞用于实验，传于放有载玻片的培养板中，待细胞接近融合，将培养孔随机分成6组，每组32孔。对照组(A组)不加药，其余每 组分别给 予 DEX(SIGMA，美国)0.4 μg/ml(B组)、DEX 0.4 μg/ml+AQP1ASODN 0.625 μg/ml(C组)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 1.25 μg/ml(D组)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 2.5 μg/ml(E组)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 5 μg/ml(F组)。第3天换培养基和重新给予同样药物。

1.3.3 免疫组化检测FN、LN、CAI及CAIV 5天后，载玻片取出，1∶1丙酮和酒精固定，PBS漂洗。正常山羊血清封闭非特异背景孵育30 min，倾去血清。分别依次滴加PBS稀释的一抗即抗FN、LN、CAI及CAIV抗体，4℃冰箱过夜，与一抗相对应的生物素标记的二抗IgG，辣根酶标记链霉卵白素。DAB显色，苏木素复染，过盐酸酒精，1‰氨水，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。空白对照组则加入PBS代替一抗，余操作步骤同。封片后每张切片随机选5个视野输入计算机，经计算机图像分析处理系统在同一光强、同一放大倍数下，检测每个视野中边界清晰、胞浆互不重叠的人眼小梁细胞核周棕黄色区域的吸光度(A值)，每种浓度重复检测3次。

1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析和q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人小梁细胞培养及特征 原代接种培养经过2周左右的潜伏期，细胞由组织块长出，形态不规则，呈内密外疏的单层生长，经8～12天细胞融合，融合时呈放射状、旋涡状，细胞体紧密连接，无重叠生长。传代。FN、LN、CAI、CAIV及NSE免疫组织化学染色阳性，结合细胞的生长过程、形态学观察及免疫组织化学特性，所培养的细胞符合人眼小梁细胞特征。

2.2 DEX、AS-ODN对小梁细胞FN、LN、CAI及CAIV表达的影响 结果显示培养的人眼小梁细胞可以合成、分泌FN、LN、CAI及CAIV。0.4 μg/ml地塞米松能刺激培养小梁细胞FN、LN及CAIV表达明显增强，使CAI表达减少，均与对照组相比差异有显著性意义。在C、D、E、F各组，AQP1AS-ODN可以降低由0.4 μg/ml地塞米松引起的FN、LN、CAIV表达增强，随着AQP1AS-ODN浓度的逐步加大，可将FN、LN、CAIV表达量降至接近正常对照组，在 LN类，甚至低于正常对照组。同时，AQP1AS-ODN可以增加由0.4 μg/ml地塞米松引起的CAI表达减少，随着AS-ODN浓度的逐步加大，可将CAI表达量增至接近正常对照组。FN类，B组与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，C、D、E、F组与A组比较差异无统计学意义。LN类，A、D组与B、C组与E、F组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。CAI类，B组与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，C、D、E、F组与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。CAIV类，B、C、D组与A组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，E、F组与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。各组平均吸光度A值见表1，图1～图4。

表1 5天后，各组小梁细胞细胞外基质平均吸光度A值

图1 FN在人眼小梁细胞的表达(×200)a:对照组，b:DEX 0.4 μg/ml组，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml组;图2 LN在人眼小梁细胞的表达(×200)a:对照组，b:DEX 0.4 μg/ml组，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml组;图3 CAI在人眼小梁细胞的表达(× 200)a:对照组，b:DEX 0.4 μg/ml组，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml组;图4 CAIV在人眼小梁细胞的表达(×200)a:对照组，b:DEX 0.4 μg/ml组，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml组

3 讨论

3.1 小梁细胞外基质中FN、LN、CAI及CAIV参与激素性青光眼的发病 小梁网由若干小梁带组成。小梁带是有很强变应性和弹性的组织，其轴心是由CAI和CAIII及弹力硬蛋白组成的胶原轴，胶原轴外环绕由CAIII、CAIV、CAV、FN和肝素硫酸盐糖蛋白构成的基质层，呈低电子密度的均质状，其最外层由小梁网内皮细胞包绕［6］。对正常眼和原发性开角型青光眼小梁网和Schlemm管基底膜中CAIV、FN及LN超微结构的特点、成分及定位的研究表明，二者是类似的［7］。

CA是构成细胞外基质的主要蛋白质。CAI为条纹胶原，存在于小梁核心、小梁柱和近小管的组织。CAIV分布于基底膜。CA的特征是形成不溶性纤维而具有高度的抗张性。如果CA的功能或数量发生异常，必将影响到细胞外基质结构和小梁网的筛状结构，从而影响到房水的排出。非胶原糖蛋白主要有 FN和 LN，两者对细胞粘着起重要作用［8，9］。二者是基膜的主要结构成分，在生物过程中扮演着重要的角色，包括细胞附着和传递、分化、迁徒和伤口治愈。FN通过细胞膜与微丝束联系。细胞一般不直接与CAIV或蛋白聚糖结合，而是通过LN将细胞固定于基膜上。FN是细胞外基质中的重要成分，主要起黏附作用，可分别与不同的大分子或细胞结合，包括胶原、肝素、纤维蛋白、肌动蛋白、转化增强因子、DNA等，同时FN与膜下微丝在细胞与底层接触区形成跨膜联系，从而影响细胞骨架排列，且对细胞有趋化和调理并加促增殖等作用［10］。有人测得牛眼房水流出道中FN浓度比血浆中低100倍，而在原发性开角型青光眼的患者眼前房流出道中浓度明显增加，尤其是在Schemm管内壁和近管组织。如果小梁细胞合成和分泌这两种蛋白浓度增加而降解酶即纤维蛋白溶酶原不增加，必将引起这两种蛋白在小梁网房水流出道中堆积，阻塞小梁网眼结构，使房水排出受阻。其中FN的增加是进行性的，有学者发现，同样情况下，人眼小梁细胞对FN的表达存在个体差异。DEX诱导下，激素敏感者表达增加，除去诱导后不可逆，但可被糖皮质激素拮抗剂部分拮抗。DEX引起细胞外基质中FN、LN的表达增加，提示二者堆积参与了激素性青光眼的发病。

3.2 AQP1参与DEX诱导的细胞外基质变化 我们的实验结果提示，DEX诱导细胞外基质中FN，LN、CAIV的表达增加，CAI表达减少。我们前期研究提示，0.4 μg/ml可以使AQP1表达较大限度的增多［4］，这与卓业鸿等［11］的研究结果是相似的，故选择用0.4 μg/ml的DEX作为AQP1表达增多的诱导剂来处理培养的人眼小梁细胞。实验在0.4 μg/ ml DEX诱导的同时，给予AQP1AS-ODN作用，旨在消除DEX所导致的AQP1表达增多带来的影响，检测AQP1AS-ODN施予前后的细胞外基质变化，探讨排除AQP1影响后的细胞外基质的表达，研究AQP1是否参与 DEX增加细胞外基质分泌的过程。AQP1AS-ODN是基因水平上AQP1的抑制剂，它特异阻断细胞内AQP1的转录与翻译。结果表明，AQP1AS-ODN在浓度用到合适的剂量时，均能逆转0.4μg/ml DEX所诱导的细胞外基质变化的现象。AQP1AS-ODN可以降低由0.4 μg/ml DEX引起的FN、LN、CAIV表达增加，随着其浓度的逐步加大，可将FN、LN、CAIV表达量降至接近正常对照组。在LN类，甚至低于正常对照组，这可能是影响了其它复杂机制。同时，AS-ODN可以增加由0.4 μg/ml DEX引起的CAI表达减少，随着AS-ODN浓度的逐步加大，可将CAI表达量增至接近正常对照组。这些都提示AQP1或以细胞膜水转运蛋白，维持细胞正常生理功能的角色，或以作用于AQP1启动子中糖皮质激素反应元件等角色参与了DEX增加细胞外基质分泌的过程。

如果我们在激素性青光眼的治疗中考虑到这一点，结合我们其它对AQP1的生理功能研究，深入AQP1在人眼小梁细胞的其它离体或在体研究，在以后科研及临床中加以明确其意义，我们将会为青光眼的防治带来新局面。

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