三种赤灵芝粉对免疫抑制模型小鼠免疫功能的调节作用

付海英 贾 婷 张英林 黛文丸 小保方技利 李 航 蔡 云 李敬轩 杨 巍

(吉林大学白求恩医学院免疫学系，长春130021)

三种赤灵芝粉对免疫抑制模型小鼠免疫功能的调节作用

付海英 贾 婷 张英林 黛文丸①小保方技利①李 航②蔡 云③李敬轩②杨 巍④

(吉林大学白求恩医学院免疫学系，长春130021)

目的:为了探讨灵芝调节机体免疫功能的作用机制，并寻找出一种能有效改善机体免疫功能的灵芝制剂，本文研究了三种赤灵芝粉对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用。方法:实验动物随机分为5组(Ⅰ～Ⅴ组)，Ⅱ～Ⅴ组采用腹腔注射环磷酰胺(CTX)70 mg·kg－1·bw－1，隔日注射，共4次，以制备动物模型，Ⅰ组注射等体积生理盐水。Ⅲ～Ⅴ组于注射CTX次日及末次注射CTX后11日内分别灌胃给予赤灵芝破壁孢子粉(D1)、赤灵芝孢子粉(D2)和赤灵芝精粉(D3)(1g· kg－1·bw－1)，定期监测小鼠体重;给药后无菌取脾脏称重，计算脾指数;采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验检测巨噬细胞吞噬功能;采用NK细胞介导的细胞毒试验检测NK细胞功能;采用淋巴细胞转化试验检测T、B淋巴细胞功能;采用流式细胞术检测CD4+T及CD8+T细胞比例。结果:与免疫抑制组相比，小鼠给予灵芝粉后，三组小鼠体重均升高(P＜0.05);D3组脾指数降低;D1和D2组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数较免疫抑制组升高(P＜0.05);三组小鼠NK细胞杀伤活性无明显变化;脾脏T、B淋巴细胞增殖能力无明显变化;D3组小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞比例明显升高，特别是CD4+T细胞升高最为显著且较正常对照高(P＜0.05)。结论:三种灵芝对免疫抑制模型小鼠的免疫功能具有调节作用，尤其是赤灵芝精粉具有显著提高CD4+T细胞数量的作用，为其临床应用提供了实验依据。

灵芝;免疫抑制;免疫调节

①日惠有限会社，日本国群马县3792222

②长春日惠食用菌研究所，长春130000

③福建省农业科学院植保所，福州350013

④通讯作者，E-mail:ywei@jlu.edu.cn

灵芝(Ganoderma)是多孔菌科植物，又称灵芝草、仙草等。灵芝种类繁多，主要分布于中国、朝鲜半岛和日本，广义上讲全世界有200余种，中国有100余种，其中以紫芝和赤芝的药用价值最高。灵芝通常以灵芝切片、灵芝粉和灵芝孢子油等形式使用，其中以灵芝粉的药理学研究较多。灵芝粉根据不同加工技术又可分为灵芝超微粉、灵芝精粉、灵芝孢子粉及灵芝破壁孢子粉等。

研究表明灵芝制剂中含有多种生物活性成分，如多糖类、三萜类化合物、生物碱、核酸类、氨基酸以及微量元素等[1-4]，使其具有保肝解毒、改善微循环、抗衰老及抗神经衰弱的作用，亦可用于治疗高血压、糖尿病、肿瘤以及艾滋病[5-7]。

此外，灵芝还具有显著调节免疫功能的作用。灵芝多糖可以显著提升小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1和TNF-α的水平以及诱导人外周血单核细胞产生TNF-α[8，9];灵芝水提物和灵芝多糖可以增加 NK 细胞活性[10];灵芝还能促进 IFN-γ 的产生[11]。

然而，由于灵芝提取部位的不同及制备工艺的差异可直接影响其药效，加上灵芝的免疫调节机制尚未十分明确。因此，本文通过三种不同的灵芝粉(包括赤灵芝破壁孢子粉、赤灵芝孢子粉及赤灵芝精粉)对免疫抑制模型小鼠的免疫功能的调节作用，比较其活性并探究作用机理，以寻找出一种有效的调节免疫功能的灵芝粉剂，为该灵芝制剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及实验动物 YAC-1细胞购自中科院上海细胞库。ICR小鼠，4～6周龄，体重18～22 g，购于吉林大学实验动物中心。

1.2 主要试剂及仪器 三种赤灵芝粉由日本日惠有限会社提供，均为褐色粉末，纯度均达到100%，其中主要有效成分为灵芝多糖;RPMI1640(Gibco公司，美国);新生牛血清(长春博德生物技术有限责任公司，中国);脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA，Sigma公司，美国);PE-anti-mCD4 mAb和FITC-antimCD8a mAb(eBioscience公司，美国);流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.3 动物模型的制备 将ICR小鼠，4～6周龄，体重为16～30 g，雌雄兼用。随机分为五组:正常对照组(Ⅰ组:19只)、免疫抑制模型组(Ⅱ组:24只)、赤灵芝破壁孢子粉(D1)组(Ⅲ组:20只)、赤灵芝孢子粉(D2)组(Ⅳ组:22只)及赤灵芝精粉(D3)组(Ⅴ组:21只)。Ⅱ～Ⅴ组小鼠于第1、3、5、7天腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺(CTX)70 mg·kg－1· bw－1，Ⅰ组小鼠腹腔注射等体积无菌生理盐水。于第2、4、6、8日及此后的11天，Ⅲ～Ⅴ组小鼠分别灌胃给予 D1、D2 和 D3(1 g·kg－1·bw－1);Ⅰ、Ⅱ组小鼠均给予同体积生理盐水。

1.4 小鼠体重及脾指数的测定 分别于实验开始前一天及第 4、8、13、18、22天称量各组小鼠体重。并于第22天处死小鼠后，分离脾脏并称重，按照下述公式计算:脾指数=脾脏重量/体重。

1.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验 于第19天给予小鼠腹腔注射3%无菌淀粉溶液1 ml，次日向小鼠腹腔注射2%鸡红细胞悬液1 ml，轻揉腹部，30分钟后，脱颈处死，取腹腔液滴于载玻片上，37℃温箱中孵育2小时。冲洗掉未黏附的细胞后，干燥，Giemsa-Wright’s染色。显微镜下计数，按下述公式计算吞噬百分率及吞噬指数:吞噬百分率=有吞噬作用的巨噬细胞/100×100%;吞噬指数=总共吞入的红细胞数/100。

1.6 NK细胞介导的细胞毒试验 采用NK细胞介导的细胞毒实验检测NK细胞活性。取小鼠脾脏，制备成无菌脾细胞悬液，调浓度为1×107个/ml，加入96孔板中，作为效应细胞，每孔100 μl(效靶比为20∶1)/50 μl(效靶比为 10∶1)，每只鼠设三复孔。将Yac-1细胞调浓度至5×105个/ml，每孔加入100 μl，作为靶细胞。37℃，5%CO2培养箱培养18小时后，加入 MTT(5 μg/ml)10 μl/孔，继续孵育 4 小时。取出后，吸去上清，加入DMSO 100 μl/孔，酶标仪上读出光密度值(OD570)。结果判断:NK活性=[1-(实验孔OD值-效应细胞对照孔OD值)]/靶细胞对照孔OD值×100%。

1.7 淋巴细胞转化试验 制备无菌脾细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×107个/ml，加入96孔板，每孔 100 μl。加入 ConA(终浓度为 5 μg/ml)用于刺激T细胞增殖或LPS(终浓度为20 μg/ml)用于刺激B细胞增殖，每个样品设3复孔。37℃、5%CO2培养箱培养48小时后，加入 MTT(5 μg/ ml)10 μl/孔，继续孵育4小时。取出后，吸去上清加入 DMSO 100 μl/孔，酶标仪上读出光密度值(OD570)。刺激指数=刺激孔OD值/对照孔OD值。

1.8 CD4+和CD8+T细胞比例测定 制备脾细胞悬液，离心，弃上清。加入适量红细胞裂解液，离心，弃上清。加2 ml PBS洗涤一次。计数，调细胞浓度为1 ×107个/ml，取 100 μl加入离心管中，避光条件下加入抗体。4℃，避光，冰浴，40分钟。1.5 ml PBS洗涤一次，弃上清。加入300 μl 2%多聚甲醛固定，用流式细胞仪进行检测。

1.9 统计学分析 所有实验数据采用 Student’s T test分析，结果用±s表示，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 三种灵芝制剂对小鼠体重及脾指数的影响结果显示(图1)，免疫抑制前(d0)各组小鼠体重无明显差别;给予免疫抑制剂后(d8)四组小鼠与正常对照组相比体重均明显降低(P＜0.05)，给药早期(d13)三种灵芝粉对抑制小鼠体重无影响，但随给药时间延长，在后期(d18、d22)可恢复免疫抑制小鼠的体重(P＜0.05)，说明三种灵芝粉均具有改善免疫抑制小鼠体重的作用，其中以赤灵芝孢子粉(D2)作用较强。而三组灵芝粉组脾指数均较CTX组有所降低，其中以D3组最为显著(P＜0.05，图2)。说明三种灵芝粉均可在不同程度改善机体脾脏功能，从而调节外周免疫应答的能力，且赤灵芝精粉(D3)的作用最强。

图1 三种灵芝粉对小鼠体重的影响Fig.1 The effect of three kinds of ganoderma powder on body weight of mice

图2 三种灵芝粉对小鼠脾指数的影响Fig.2 The effect of three kinds of ganoderma powder on mice spleen index

2.2 三种灵芝制剂对巨噬细胞吞噬功能的影响与Control组相比，CTX组及三组灵芝粉组小鼠的吞噬百分率均降低，但无统计学差异(图3A);与Control组相比(图3B)，CTX组小鼠的吞噬指数明显降低(P＜0.05)，而D1、D2组小鼠吞噬指数较CTX组明显升高(P＜0.05)，D3组略升高但无统计学差异(P＞0.05)。说明三种灵芝粉可不同程度增强巨噬细胞吞噬能力，其中赤灵芝孢子粉的作用最为显著。

2.3 三种灵芝制剂对NK细胞杀伤功能的影响结果显示(图4)，CTX组及三组灵芝粉组NK细胞活性均低于正常对照组;在效靶比为10∶1时，尽管三种灵芝粉组NK细胞活性较CTX组有所升高，但均无统计学意义。说明三种灵芝粉均有提高免疫抑制模型鼠NK细胞活性的趋势，但并不显著。

图3 三种灵芝粉对巨噬细胞吞噬功能的影响Fig.3 The effect of three kinds of ganoderma powder on phagocytic activity of macrophage

2.4 三种灵芝制剂对T、B细胞增殖功能的影响结果显示(图5)，与Control组相比，CTX组及 D1、D2组B细胞的刺激指数均降低(P＜0.05)，CTX组及D1、D2和D3组 T细胞刺激指数无明显变化(P ＞0.05);与CTX 组相比，D1、D2及D3组T、B 细胞的刺激指数变化均不明显(P＞0.05)，说明三种灵芝粉对T、B淋巴细胞的增殖功能均无明显影响。2.5 三种灵芝制剂对CD4+及CD8+T细胞比例的影响 结果显示(图6)，D3组的CD4+T细胞明显高于 Control组及 CTX组(P＜0.05);且 D3组CD8+T细胞亦较CTX组升高(P＜0.05);其它组间无明显差别。说明赤灵芝精粉具有明显提高机体T淋巴细胞数量的作用，特别是对CD4+T细胞的影响最为显著，进而提示其在增强机体免疫功能中发挥着重要作用。

图4 三种灵芝粉对NK细胞杀伤功能的影响Fig.4 The effect of three kinds of ganoderma powder on cytotoxicity of NK cells

图5 三种灵芝粉对T、B细胞增殖功能的影响Fig.5 The effects of three kinds of ganoderma powder on proliferation of T and B lymphocytes

图6 三种灵芝粉对CD4+T及CD8+T细胞比例的影响Fig.6 The effects of three kinds of ganoderma powder on the percentage of CD4+and CD8+T lymphocytes

3 讨论

临床研究和现代药理证明，灵芝具有多种生理活性和药理作用[5-7]。它能够影响天然和获得性免疫系统中的多种细胞的功能，如巨噬细胞、NK细胞和淋巴细胞[8，10，11]等。此外，研究发现灵芝多糖能够结合到淋巴细胞表面与特异性受体或相似的蛋白结合导致巨噬细胞、辅助性T细胞、NK细胞和其它效应细胞活性的改变。这也许能够解释为什么灵芝的免疫调节功能如此广泛[12]。

关于灵芝的研究，以往多采用肿瘤模型鼠探讨其抗肿瘤作用。而本研究则以免疫抑制模型鼠为对象，结果显示赤灵芝孢子粉和破壁孢子粉可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，而赤灵芝精粉无明显作用。这与李怡岚等[13]研究显示破壁孢子粉可增强S180肿瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能，而灵芝精粉无明显变化的结果一致，但其并未对孢子粉的作用进行研究，而本研究显示在三种灵芝粉中孢子粉的作用最为显著，这可能是由于影响巨噬细胞作用的有效成分主要存在于灵芝孢子中，而破壁可能会使其部分活性成分降低，其具体原因还有待于进一步研究证明。此外，本研究结果显示三种灵芝粉对NK细胞功能影响均不明显，相反另一报道则显示灵芝精粉和破壁孢子粉均具有提高S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤功能，且以破壁孢子粉作用较强[13]。这可能是由于不同动物疾病模型对药物的敏感性不同，或给药方式和剂量的不同所致。

在本研究中，三种灵芝粉对免疫抑制模型小鼠脾淋巴细胞的增殖均无明显影响。尽管有报道显示，灵芝孢子粉可促进ConA诱导的NIH小鼠脾淋巴细胞增殖，从破壁的灵芝孢子粉中分离得到多糖SP及其降解片段SP21，腹腔注射给药后均可促进ConA及LPS诱导的ICR小鼠脾淋巴细胞增殖[14，15]。而另一些研究显示，一种从灵芝破壁孢子粉中分离纯化的多糖组分PGL却能明显抑制ConA和LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖[16]。因此关于灵芝对脾淋巴细胞增殖的作用还存在争议，这可能是由于不同的提取方法所获成分不同，而不同的成分又具有不同的生物学活性。

本研究显示，不同的灵芝粉对免疫功能具有不同的调节作用。对天然免疫功能的调节作用，如对巨噬细胞吞噬功能的影响以赤灵芝孢子粉最为显著，而对适应性免疫功能的调节作用则是赤灵芝精粉的作用最强，特别是对CD4+和CD8+T细胞的影响。有研究显示腹腔注射灵芝孢子粉可明显提高荷HAC肝癌小鼠CD3+、CD4+及CD8+T细胞的百分率[17]，破壁孢子粉可增加S180荷瘤小鼠CD4+及CD8+T细胞的数量，但与灵芝精粉之间的作用比较却未见报道。灵芝粉中另一重要活性成分为腺苷，它也是冬虫夏草的主要活性成分，不同的灵芝提取物其腺苷含量不同，灵芝精粉的含量较高可达0.2%左右，而孢子粉及破壁孢子粉的含量仅为0.01%左右，这也可能是灵芝精粉作用较强的原因[18]。

传统认为CD4+T细胞主要为辅助性T细胞，分为Th1和Th2型两种，能够分泌产生多种细胞因子，进而在辅助CD8+T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答中发挥重要作用，因此是参与免疫应答中至关重要的一类细胞，其功能的高低直接影响机体免疫功能的强弱，本研究发现赤灵芝精粉对CD4+T细胞具有显著的调节作用，提示可能通过增加CD4+T细胞的数量，从而对适应性免疫应答的整体功能发挥调节作用，通过提高机体免疫功能，有助于机体抵抗感染、肿瘤等多种疾病的发生发展。

不同类型的灵芝制剂对免疫功能调节作用的不同，可能是由于提取工艺不同导致其有效成分的组成及含量不同，从而导致对不同免疫细胞的影响存在差异。但这还有待于进一步研究证实。总之，本研究提示不断完善灵芝制剂的加工提取工艺，针对不同疾病需要选择其相应的更为有效的灵芝制剂，为临床应用灵芝治疗疾病提供了实验依据。

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[收稿2012-03-02 修回2012-05-14]

(编辑 倪 鹏)

The role of three kinds of ganoderma lucidum powder on regulation of immune functions of immunosuppressive mice model

FU Hai-Ying，JIA Ting，ZHANG Ying-Lin，Fumimaru Mayuzumi，Eri Obokata，LI Hang，CAI Yun，LI Jing-Xuan，YANG Wei.Department of Immunology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China

Objective:In order to explore the mechanism of ganoderma powder on regulating immune functions，and find out a kind of ganoderma powder for improving immune functions effectively.In this study，the role of three kinds of ganoderma lucidum powder on regulation of immune functions of immunosuppressive mice model was investigated.MethodsThe mice were divided into five groups(Ⅰ-Ⅴ)randomly，mice in group Ⅱ-Ⅴ were injected intraperitoneally with cyclophosphamide(CTX)70 mg·kg－1·bw－1every other day for four times to establish the animal model.Mice in group Ⅰ were injected with normal saline equally.Group Ⅲ-Ⅴmice were treated respectively with wall-broken spores of ganoderma lucidum(D1)，ganoderma lucidum spore powder(D2)and ganoderma lucidum powder(D3)(1 g·kg－1·bw－1)at the following day of CTX injection and for eleven days after the last time of CTX injection.The body weights of mice were measured at certain time.The spleens were removed sterilely and weighted to calculate the spleen index.The phagocytic ability of macrophage was detected with mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken red cell test.The function of NK cells was detected with NK cells mediated cytotoxicity assay.The functions of T and B lymphocytes were analyzed with lymphocyte proliferation assay.The percentage of CD4+and CD8+T lymphocytes were analyzed with FACS.ResultsCompare to the immunosuppressive mice，the body weight of mice treated with three kinds of ganoderma lucidum powder increased(P ＜0.05)，the spleen index in group D3 decreased，the phagocytosis index in group D1 and D2 mice were higher than immunosuppressive mice(P ＜0.05).There were no significant changes of NK cell activity in ganoderma-treated mice.There were no obvious changes of the proliferation ability of T and B lymphocytes between ganoderma-treated mice and CTX mice.The percentage of CD4+and CD8+T lymphocytes in spleen of group D3 mice were significantly increased than those in immunosuppressive mice，especially the the percentage of CD4+T in group D3 mice was most significantly increased and even was higher than those in normal control mice(P ＜0.05).ConclusionThree kinds of ganoderma lucidum could regulate the immune functions of immunosuppressive mice，especially the ganoderma lucidum powder is able to increase the number of CD4+T lymphocytes，which provide the experimental basis for its clinical application.

Ganoderma powder;Immune suppression;Immunoregulation

R392

A

1000-484X(2012)08-0712-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.008

付海英(1977年－)，女，博士，讲师，主要从事免疫调节方面研究，E-mail:fuhaiying612@yahoo.com.cn。

·兽医免疫学·