成人牙面色素沉积与口腔产黑菌关系的研究

张明珠，税艳青，吕罕鲜，任晓斌，黄松靖，王小洁

(云南昆明:1.昆明医学院附属口腔医院口腔内科，650031;2.省第一人民医院口腔预防科，650032)

口腔色素沉积是一种常见的影响口腔健康和美观的因素之一。正常牙为淡黄半透明的象牙色，其颜色的改变常由两种原因造成:一种是由于外来色素在牙齿表面沉积，称外源性着色;另一种是由于牙齿本身的原因或全身性病造成的色泽改变，称为牙齿变色或内源性着色。外源性着色常见原因有:食用含色素的物质、特殊工种从业人员长期接触的无机盐和化学物质、口腔中的产色素细菌感染等。

大量研究表明口腔产黑菌有产生黑色素的功能［1-3］，其中产黑色素类厌氧杆菌(Black-Pigmented Anarobic Bod，BPB)是一组从口腔分离的G-厌氧杆菌，包括牙龈卟啉单胞菌(Pg)、牙髓卟啉单胞菌(Pe)、中间普氏菌(Pi)和变黑普氏菌(Pn)等［4］。临床研究发现:BPB能够通过吸附装置粘附于黏膜、龈沟上皮细胞表面，与宿主相互作用，影响口腔卫生健康。

虽然BPB能够产生黑色素，但目前关于BPB与口腔内色素沉积之间的关系报道甚少，本研究将对此进行初步研究，为临床制定控制色素的对策提供参考。

1 材料和方法

1.1 受试对象选择

从昆明医科大学附属口腔医院口腔综合科选择18～40岁牙面有色素沉积的志愿者30人(均为非吸烟和非食用含色素物质者，色素沉积面积超过牙颈1/3，达冠中1/3以上);同时选择18～40岁牙面无色素沉积的志愿者30人作为对照。所有受试者均排除龋病、非龋性病和牙龈炎，3个月内未使用过抗生素，知情同意。

1.2 牙菌斑标本采集

分别用探针采集每个受试者混合牙菌斑1 mg，立即放入含1 mL硫乙醇酸盐传输液的离心管内，-20℃保存备用。

1.3 菌斑内4种产黑色素类杆菌的检测

1.3.1 DNA抽提

分别取上述冻存的所有菌斑样本，经冻融后10 000 g离心3 min弃上清，使用QIAGEN DNA Mini kit试剂盒提取菌斑DNA(抽提过程按厂商说明)(表1)。

表1 引物序列和产物［5］

1.3.2 PCR扩增反应

采用二步PCR法对样本进行扩增:①首先利用细菌通用引物［5］，产生全长的16S-rDNA产物，再以该产物为模板，采用细菌特异引物扩增相对应的目标细菌DNA(引物序列和退火温度参见表1);②PCR反应，反应体系 50 μL:3 μL dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L)，5 μL 10 ×bufferⅡ，0.5 μL DNA Polymerase(5 U/μL)，特异引物各0.5 μL(25 mmol/L)，模板1 μL，去离子水加至50 μL;③PCR反应条件为:一步扩增条件: 97℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环;二步扩增条件:95℃变性1 min，退火30 s，72℃延伸30 s，26个循环。最后72℃优化7 min;④扩增产物使用含0.5 μg/mL溴化乙锭液的10 g/L琼脂糖凝胶电泳40 min(恒压6V/cm)，紫外灯观察目标片段大小是否符合理论值的PCR产物。并计算各组各种细菌的检出率。

1.4 统计学分析

实验组与对照组各菌检出率比较用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果(表2，图1)

表2 各组4种细菌的检出率比较 (%)

图1 Pg、Pe、Pi、Pn PCR检测电泳图

全部样本至少有一种目标细菌被检出，大多数样本以细菌混合感染为主，无色素沉积的标本中Pg、Pe、Pi、Pn检出率分别为27%、40%、30%、87%;有色素沉积样本中检出率分别为 60%、80%、73.3%、80%。统计学分析显示:有色素沉积者Pg、Pe、Pi的检出率明显高于无色素沉积者(P＜0.05)，Pn二组无统计学差异(P＞0.05)。

3 讨论

大量研究表明:BPB与牙髓感染、牙周炎都相关［6］，Pg、Pe、Pi、Pn在髓腔未暴露的慢性根尖周炎中的检出率分别为36.67%、50%、16.67%、43.33%;在髓腔未暴露的牙髓炎检出率分别为20%、36.67%、10%、20%［7］。本研究中上述4种细菌在色素沉积组的检出率分别为60%、80%、73.3%、80%，明显高于感染根管内的检出率，表明开放口腔内的细菌量和细菌种类多于封闭的根管，牙面色素沉积可能与这几类产黑菌定植有关。

目前，虽然对BPB在牙面色素沉积方面的研究甚少，但有些间接研究表明:外源性着色，特别是与血红素相关的色素沉积与产黑菌有关，Smalley［1］研究表明，Pg的牙龈素成分与高铁血红蛋白形成有关，高铁血红蛋白则与二聚血红色素形成有关;高铁血红蛋白可以有效阻碍血红素溶解，防止血红蛋白消退，所以牙龈素可促进血红素的形成。此后Smalley［8］(1998)研究又发现:Pg精氨酸和赖氨酸特异性牙龈蛋白酶与血红蛋白的降解有关，氧化血红蛋白与Pg精氨酸特异牙龈蛋白酶-R结合可导致高铁血红蛋白的形成，高铁血红蛋白被特异牙龈蛋白酶K降解，最终导致原卟啉铁的释放，从而促进色素形成。Pi和Pn在低pH值环境中，可形成高铁血红蛋白并降解产生卟啉铁，低pH值又可导致不溶性卟啉铁的沉积，从而促进色素沉积［3，8］。本研究在排除主要通过食物性色素来源的情况下，分别对30例有色素和无色素沉积者的菌斑样本进行检测，发现有色素沉积者菌斑样本中Pg 18(60%)、Pe 24(80%)、Pi 22(73.3%)的检出率明显高于无色素沉积者，提示这几类产黑菌可能与非食物性牙面色素沉积有密切关系。

［1］ Smalley JW，Birss AJ，Szmigielski B，et al.Mechanism of methaemo-globin breakdown by the lysine-specific gingipain of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis［J］.Biol Chem，2008，389(9):1235-1238.

［2］ Smalley JW，Birss AJ，Szmigielski B，et al.Sequential action of R-and K-specific gingipains of Porphyromonas gingivalis in the generation of the haem-containing pigment from oxyhaemoglobin［J］.Arch Biochem Biophys，2007，465(1):44-49.

［3］ Smalley JW，Silver J，Birss AJ，et al.The haem pigment of the oral anaerobes Prevotella nigrescens and Prevotella intermedia is composed of iron(Ⅲ)protoporphyrin IX in the monomeric form［J］.Microbiol，2003，149(Pt7):1711-1718.

［4］ 刘正.口腔生物学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2007:70-82.

［5］ Siqueira JF Jr，Rôças IN，Alves FR，et al.Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals:a molecular investigation［J］.J Endod，2004，30:638-643.

［6］ 严杰，陈莉丽，朱仲珍，等.牙周炎患者龈下厌氧菌的分离和鉴定［J］.浙江医科大学学报，1993，3(22):122-124.

［7］ 刘海霞.产黑色素类杆菌在感染根管内的研究［D］.长沙:中南大学硕士学位论文，2008.

［8］ Smalley JW，Silver J，Marsh PJ，et al.The periodontopathogen Porphyromonas gingivalis binds iron protoporphyrin IX in the mu -oxo dimeric form:an oxidative buffer and possible pathogenic mechanism［J］.Biochem J，1998，331(Pt 3):681-685.