间充质干细胞-透明质酸-多聚赖氨酸治疗脊髓损伤的实验研究

Raynald，李延滨，郭牧遥，黄 华，张 涵，于 昊，李海龙，崔福斋，安沂华

（1.首都医科大学，北京市神经外科研究所，北京 100050；2.清华大学材料科学与工程系，北京 100084）

脊髓损伤是一种严重危害人类健康的中枢神经系统疾病，可导致感觉和运动功能丧失，目前对其后遗症缺乏有效的治疗手段。随着干细胞及组织工程学技术的发展，细胞复合生物材料移植治疗中枢神经系统损伤得到了更多的关注。本研究利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，透明质酸—多聚赖氨酸材料作为支架，研究其复合物对脊髓损伤的修复效果。

1 材料和方法

1.1 材料

Spraque Daw ley（SD）大鼠（中国医学科学院实验动物研究所SCXK（京）2009-0017）；细胞培养试剂：DMEM，10％牛血清（GIBCO Company）；手术器械：YZ20P5手术显微镜（苏州六六视觉科技股份有限公司）；倒置显微镜（Nikon）；电镜（Hitachi TEM system）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将5 mL已抗凝的人骨髓与等体积PBS混合，室温下900 g离心10 min，沉淀物用PBS洗2次；细胞重悬，密度为4×107/mL；密度梯度离心法分离单个核细胞，重悬于DMEM（低糖）+ 15％胎牛血清培养基中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；每3～4 d换一次培养基；细胞至90％融合时，0.25％胰酶/EDTA消化，传代培养；

1.2.2 透明质酸-多聚赖氨酸（HA-PLL）材料的制备：HA在EDC（碳化二亚胺，1-（3-dimethylam inopropyl）-3-ethylcarbodiim ide）的介导下与PLL反应，避光过夜保存，溶液缓慢交联成凝胶；将上述凝胶用去离子水在超声波中清洗三次去除残留物，-20℃冷冻后放入冻干机内进行冷冻干燥。48 h后得到多孔框架材料［1］。

1.2.3 实验动物分组：体重200～220 g的雌性SD大鼠32只，随机分为4组，单纯损伤组（8只）、hBMSC移植组（8只）、HA-PLL移植组（8只）、hBMSC-HA-PLL移植组（8只）。

1.2.4 脊髓半横断模型的制作：水合氯醛（0.4 m L/100 g）腹腔注射麻醉。取俯卧位，无菌状态下充分暴露T6-T7节段的脊髓，将其半横断，纵向去除脊髓组织的长度为2 mm，然后根据分组情况，将hBMSC、材料或hBMSC+材料植入脊髓缺损区域，逐层缝合。

1.2.5 大鼠运动功能的检测：于术后8周内每周1次观察大鼠运动功能恢复情况。评价方法参照BBB运动评分法［2］。

1.2.6 损伤部位形态学评价：术后8周杀死大鼠，利用电镜观察各组损伤局部是否有新生轴突和血管出现，并比较其形态差别。

1.2.7 统计学分析：大鼠运动功能的评分用平均值±标准差表示（±s），使用SPSS软件进行重复测量方差分析，P＜0.05表示为有显著性差异。

2 结果

2.1 动物行为学恢复情况

动物行为学变化主要是观察损伤侧下肢运动功能的恢复情况。观察运动功能行为分为3个阶段：早期主要观察后肢关节的运动，中期主要观察平衡能力与步态运动，晚期主要观察下肢足部精细运动。8周内观察可见，HA-PLL组大鼠的运动功能与单纯损伤组相比评分差异无统计学意义，hBMSC移植组的运动功能恢复程度明显好于上述两组（P＜0.05），hBMSC-HA-PLL组的运动功能恢复程度则明显好于单纯损伤组及HA-PLL组（P＜0.05），但与hBMSC移植组相比差异无统计学意义（表1）。从恢复的时间段来看，在损伤后急性期改善程度较亚急性期显著。4组中，hBMSC组及hBMSC-HAPLL移植组恢复的速度最快，尤其是在第一周时明显高于对照组及HA-PLL组，两周后对照组及HAPLL组也出现明显的恢复，而hBMSC组及hBMSCHA-PLL组的恢复速度则有所减慢，但评分仍要好于对照组及HA-PLL组，而到5周以后各组的恢复程度几乎没有明显变化（图1）。

表1 表1 脊髓损伤术后1至8周BBB评分各组变化Tab.1 1st week to 8th week post-spinal cord injury each group BBB score

图1 脊髓损伤术后1至8周BBB评分各组变化Fig.1 1st week to 8th week post-spinal cord injuryeach group BBB score

2.2 电镜评价损伤局部形态

利用电镜观察新生轴突和血管生长情况。电镜结果显示：HA-PLL移植组和hBMSC-HA-PLL移植组，在有材料存在的脊髓损伤区域，可见新生神经纤维，包括有髓纤维和无髓纤维，其中大部分的新生神经纤维有施万细胞围绕（彩插2图2），与HA-PLL组相比，hBMSC-HA-PLL组新生轴突的数量要更多，轴突的髓鞘形态较为完整，板层明暗相间，结构清晰，轴浆内细胞器丰富，且未见明显髓鞘变性，两组的材料内部都偶见新生血管形成，血管形态基本正常，血管内皮细胞生长良好（彩插2图3）。单纯损伤组的损伤区域主要被胶原和纤维细胞填充，偶见有孤立的新生轴突生成，但生长欠佳，而在有材料植入的损伤区域胶原及纤维细胞明显减少。在单纯细胞移植组，损伤局部也有新生神经纤维生成，新生轴突的髓鞘也较完整，但与HA-PLL移植组及hBMSC-HA-PLL移植组相比，其胶原及纤维细胞的成分更多，胶质瘢痕的生成更为丰富，但少于单纯损伤组。

3 讨论

脊髓损伤后，轴突的再生能力极为有限，因而此类患者往往遗留有严重的终生残疾。如何有效促进此类患者损伤的中枢神经的再生，改善其神经功能，成为目前国际上的研究热点。国内外许多研究证明，hBMSC在中枢神经系统损伤修复中具有巨大潜力。hBMSC具有干细胞多向分化和自我更新的潜能，且获取途径避免了相关伦理学争议，体外扩增相对简便且性质稳定，拥有更加广阔的临床应用前景。本研究选择hBMSC作为种子细胞，结合组织工程学技术治疗大鼠脊髓损伤。

脊髓损伤导致神经元及胶质细胞死亡、功能丧失以及胶质疤痕形成，胶质疤痕主要由反应性星形胶质细胞组成，可阻碍轴突再生和延伸［3，4］。上述改变在单纯损伤组中有所体现。本研究采用多孔的HA-PLL水凝胶作为支架，希望其材质可有利于神经功能的恢复：其多孔的表面形态有利于细胞的贴附和生长。在有材料存在的组中可见：材料移植区损伤区域变窄，其内有新生轴突和血管，同时可见动物在行为学方面有所恢复［5-7］。上述结果说明，HA-PLL水凝胶在一定程度上可以减轻胶质瘢痕的形成，为轴突再生和移植细胞发挥作用提供相对良好的微环境，这与其他相关研究的结果基本一致。其机制可能包括：HA-PLL水凝胶的存在可以维持组织的形态结构；在细胞生长和物质交换方面起到重要作用，有利于损伤轴突的再生；同时材料本身的材质可以消除细胞周围的水肿、诱导新生血管的形成，进一步促进轴突的再生［8-10］。

本研究结果显示，有干细胞移植的两组动物损伤恢复程度更好。BBB评分显示脊髓损伤后急性期，hBMSC组和hBMSC-HA-PLL组评分显著高于对照组和HA-PLL组，在亚急性期评分也略微高于后两组。而8周时的BBB评分表明，HA-PLL组大鼠的运动功能与单纯损伤组相比评分差异无统计学意义，而hBMSC移植组和hBMSC-HA-PLL组的运动功能恢复程度明显好于没有移植细胞的两组（表1，P＜0.05）。已知hBMSC可分泌许多营养因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子-3 （NT-3）、血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素生长因子-1（IGF-1），等等。这些神经营养因子对神经系统的损伤修复发挥着重要作用。推测这些hBMSC分泌的细胞因子和细胞外基质促进了损伤轴突的再生、填充损伤区域并恢复脊髓的信号传导、减轻胶质疤痕对轴突延伸的抑制效应，从而促进神经修复［3，4，11-14］。

虽然HA-PLL材料本身的确可以改善损伤微环境，有利于神经再生。但在本研究中，四组的BBB评分统计学分析表明，HA-PLL似乎对神经修复并无影响，推测有以下两种可能：一是HA-PLL本身对神经修复的影响不如干细胞显著；二是BBB评分对神经功能的评价不如神经电生理检查敏感，虽然可以检测出比较明显的神经功能差异，但对不甚明显的差异可能表现欠佳。这一点在我们随后的实验研究中已经得到初步证实（数据未显示）。

综上所述，联合应用hBMSC-HA-PLL能够促进大鼠运动功能的恢复，其具体机制仍需要进一步的深入研究。

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