Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响

马小茗，林培容，陈陟阳，鞠振宇

（1.中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021；2.北京华信医院，北京 100016）

Gadd45（Growth arrest and DNA damage inducible gene Gadd45）家族包括3个成员：Gadd45α （Gadd45α/Gadd45）、Gadd45b（Gadd45β/ MyD118）、Gadd45g（Gadd45γ/CR6），它们在细胞周期、细胞凋亡等方面起到重要的作用［1-3］。Gadd45α是Gadd45基因家族中唯一的p53靶基因［4］，它在细胞的生命过程中起到重要的作用，其中包括遗传物质稳定性的维持［5］、细胞周期的调控［6］、核苷酸剪切修复［7，8］以及凋亡调控［9，10］等。研究认为，Gadd45基因家族在生理或环境的压力作用下诱导快速表达，引起细胞周期抑制、DNA修复、细胞存活或凋亡。Gadd45作为压力刺激敏感的基因，其功能主要是与细胞周期调节相关的重要蛋白、分子等相互作用［11］。

造血细胞包括造血干细胞和造血祖细胞，对放射线照射非常敏感。5～10Gy的放射线照射剂量很可能导致小鼠造血系统破坏从而导致死亡［12］。已知Gadd45α作为压力刺激敏感反应基因，唯一的Gadd45家族中p53下游的靶基因，而p53作为应激反应的重要信号通路，调节细胞的增殖、DNA修复以及凋亡，从而研究Gadd45α基因敲除小鼠造血干细胞的功能意义重大。

1 材料和方法

1.1 动物及设备

本实验所用的小鼠：Gadd45α-/-（来自北京协和医学院比较医学中心）小鼠（遗传背景：C57BL/ 6J）12周龄；野生型小鼠采用同窝对照小鼠C57BL/ 6J（来自北京协和医学院比较医学中心）12周龄。动物许可证号SCXK（京）2009-0007。

设备为：美国BD公司Aria流式细胞仪； Olympus荧光显微镜；Them ro水套式细胞培养箱；超净工作台等。

1.2 方法

1.2.1 PCR方法鉴定Gadd45a-/-小鼠基因型

小鼠在出生10 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，裂解组织提取基因组DNA，PCR鉴定基因型，反应条件：94℃预变性3 m in；变性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，35个循环；72℃延伸3 m in。鉴定引物为Gadd45a w t：5＇-cct ctg ctt acc tct gca caa-3＇；Gadd45a cm：5＇-gaa gac cta gac agc acg gtt-3＇；Gadd45am t：5＇-aga acg aga tca gca gcc tct-3＇； Gadd45a-/-产物长度211 bp，WT产物长度324 bp，PCR试剂购自上海生工生物技术有限公司，中国。

1.2.2 骨髓干细胞体外克隆形成实验

选用12周龄的Gadd45α-/-及C57BL/6J小鼠，常规制备骨髓细胞并进行骨髓长期造血干细胞表面荧光标记，使用流式细胞仪（MACS富集后）分选表面标记为Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-的单个造血干细胞与U型底96孔板中。将其进行钴60来源的放射线照射（irradiation，IR），剂量为2Gy。照射后在96孔板中进行单个干细胞的培养，14d时记录克隆的数目和大小，比较长期造血干细胞的数量和自我更新能力。

1.2.3 竞争性骨髓移植实验

受体小鼠（CD45.1）经过60Co全身照射，剂量率0.5～1 Gy/min，总剂量9 Gy；供体小鼠、竞争者小鼠（CD45.1/2）处死取股/胫骨，研磨制备细胞悬液，将细胞浓度调至2×107/m L，供体与竞争者骨髓细胞比例按1∶1，将每组供体骨髓细胞与竞争者骨髓细胞混匀，通过眼后静脉丛或鼠尾静脉注射，每只受体小鼠接受注射液体总量控制在200～300μL，含单个核骨髓细胞约1×106个。

移植后受体均给予抗生素一周（饮水中添加乳酸左氧氟沙星0.5 mg/m L）。

移植后注意饮食饮水补给，以提高移植成活率。

1.2.4 放射线照射全骨髓移植受体小鼠—生存曲线实验

受体小鼠C57BL/6J经过60Co全身照射，剂量率0.5～1 Gy/min，总剂量9 Gy；供体小鼠Gadd45α-/-及同窝对照C57BL/6J，分别取全骨髓细胞1×106于250μL无菌PBS中，经眼后注射至新的受体小鼠。移植3个月造血重建稳定后，给予8.5Gy的60Co照射，观察其存活情况。

2 结果

2.1 PCR鉴定结果

剪取10d的小鼠脚趾，以饱和氯化钠法提取小鼠基因组DNA，进行PCR，产物经2％琼脂糖凝胶电泳，野生型产物长度为324 bp，Gadd45a缺失产物长度211 bp。

图1 PCR鉴定Gadd45a基因敲除小鼠的凝胶电泳分析Fig.1 PCR genotyping of the Gadd45a kockoutmice注：Marker为DL2000 marker，H 2 0为空白对照，WT为（C57BL/6J）野生型对照，KO为（Gadd45α-/-）基因敲除对照Note：Themarker is the DNA molecular weightmarker；H2 O indicates the negative control；WT：wild-type control；KO：Gadd45a gene knockout control

2.2 骨髓干细胞体外克隆实验结果

长期造血干细胞（long-term hematopoietic stem cells，LT-HSC）具有自我更新及多向分化能力，单克隆培养能够很好的反应其功能。应用流式细胞仪将表面标记为Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-的1个LT-HSC细胞分选至96孔板一孔中，在含有细胞因子的培养条件下，体外培养14 d后观察单克隆形成情况。结果如图2所示，图2A分别为C57BL/6J的LT-HSC克隆，Gadd45α-/-的LT-HSC克隆，IR后C57BL/6J的LT-HSC克隆，IR后Gadd45α-/-的LT-HSC克隆。结果显示，Gadd45α-/-的LT-HSC与C57BL/6J的相比有显著的抗放射能力。统计结果图2B所示，IR后C57BL/6J的LT-HSC无克隆形成，而Gadd45α-/-的LT-HSC仍能形成大克隆，有明显的抗放射能力。

图2 长期造血干细胞体外克隆结果Fig.2 The Resultsof LT-HSC clone form ing in vitro注：A为WT LT：C57BL/6J小鼠的Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-克隆结果；KO LT：Gadd45α-/-小鼠的Lineage-Sca1+ckit+ CD34-Flt3-克隆结果；IR WT LT：2Gy放射线照射后，C57BL/6J小鼠的Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-克隆结果；IR KO LT：2Gy放射线照射后，Gadd45α-/-小鼠的Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-克隆结果；B为C57BL/6J、Gadd45α-/-以及放射线照射后C57BL/6J、Gadd45α-/-LT-HSC克隆形成统计结果Note：A WT LT：The Results ofC57BL/6Jmice Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-clone forming；KO LT：The Resultsof Gadd45α-/-mice Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-clone forming；IR WT LT：After 2Gy irradiation，the Results of C57BL/6Jmice Lineage-Sca1+ ckit+CD34-Flt3-clone forming；IR KO LT：After 2Gy irradiation，the Results of Gadd45α-/-mice Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-clone forming；B：The statistical Results of C57BL/6J、Gadd45α-/-and post-irradiation LT-HSC clone forming

2.3 竞争性骨髓移植实验

竞争性骨髓移植是评价造血干细胞自我更新能力的标准试验。放射性照射摧毁受体小鼠自身免疫系统，并使自身干细胞从龛中移除易于外源供体的植入。供体来源的骨髓造血干细胞在造血重建的过程中，移植后1个月时，对外周血细胞的贡献在主要来自于短期骨髓干细胞的造血及分化能力，在3个月后则来自于长期干细胞的造血及分化能力。如图3所示，竞争性骨髓移植观察造血干细胞功能，Gadd45α基因敲除小鼠的长期造血干细胞与C57BL/6J的相比在一次竞争性骨髓移植3个月内并无显著差异。

2.4 放射线照射全骨髓移植受体小鼠—生存曲线实验

图3 竞争性骨髓移植结果Fig.3 The Results of competitive transplantation注：A竞争性骨髓移植一个月外周血嵌合率；B竞争性骨髓移植二个月外周血嵌合率；C竞争性骨髓移植3个月骨髓嵌合率Note：A：The chimerism of competitive bonemarrow transplantation in peripheral blood after the firstmonth；B：The chimerism of competitive bone marrow transplantation in peripheral blood after the second month；C：The chimerism of competitive bone marrow transplantation in bone marrow after the third month

Gadd45α作为压力刺激敏感反应基因，在各种生理或环境的压力作用下诱导快速表达，低剂量的放射线照射长期造血干细胞观察，Gadd45α基因缺失长期造血干细胞有抵抗低剂量放射线照射的能力；而在连续移植的压力下，Gadd45α基因缺失的长期造血干细胞能力又远远下降。放射线照射是临床放疗的治疗手段，Gadd45α基因是否能抵抗放射线对造血干细胞功能的影响意义重大。8.5 Gy的放射线照射全骨髓移植后3个月的受体小鼠，观察其生存情况，结果如图4所示，8.5 Gy的放射线损伤，Gadd45α-/-与C57BL/6J全骨髓移植后的受体小鼠存活情况无显著差异。

图4 8.5 Gy放射线照射后生存曲线Fig.4 Survival curves after 8.5 Gy irradiation注：Gadd45α-/-与C57BL/6J分别为供体全骨髓移植受体小鼠3个月后，8.5 Gy放射线照射受体，红色代表Gadd45α-/-移植的受体小鼠生存情况，黑色代表C57BL/6J移植的受体小鼠生存情况Note：Gadd45α-/-and C57BL/6J transp lant recipient mice.A fter 3 months，8.5 Gy irradiation receptors，red represents the survival of Gadd45α-/-mice，black represents the survival of C57BL/6J recipientmice

3 讨论

已有研究证明，Gadd45a作为p53下游靶基因，参与众多细胞信号通路的调控，对细胞周期、凋亡等过程中起重要的作用。研究报导，紫外照射刺激下，Gadd45a通过Gadd45a-p38-NF-kB信号通路促进细胞存活［13］。Gadd45a基因敲除小鼠在紫外的刺激下，骨髓细胞凋亡增加，c IAP-1，Bcl-2，Bcl-xL等表达下降［14］。

Gadd45a基因在造血干祖细胞功能中作用鲜有研究，我们建立了Gadd45a基因单敲除小鼠，采用流式细胞仪分选骨髓造血干细胞，在2Gy的放射线刺激下，检测造血干细胞的克隆形成能力，发现Gadd45a基因敲除与C57BL/6J相比更加抵抗低剂量辐射，维持造血干细胞功能。为了更进一步了解Gadd45a基因敲除对造血干祖细胞功能的影响，进行竞争性骨髓移植实验，连续观察3个月的结果显示，Gadd45a基因敲除小鼠的造血干细胞功能与C57BL/6J小鼠的造血干细胞功能相比并无显著差异。Gadd45a基因对各种生理或环境的压力作用下都会被快速的诱导表达，高剂量放射线照射全骨髓移植3个月后的受体小鼠发现，Gadd45a基因的有无对高剂量的放射线损伤无显著差异。

Gadd45作为压力刺激敏感的基因，其功能主要是与细胞周期调节相关的重要蛋白、分子等相互作用。低剂量的放射损伤后，Gadd45a基因敲除小鼠的长期造血干细胞自我更新能力增强，而Gadd45a基因的有无对高剂量的放射线损伤反应无显著的差异。竞争性骨髓移植观察Gadd45a基因敲除一次移植造血重建功能并无影响。在放射线损伤情况下，Gadd45a基因缺失短期内可能激活p38信号通路促进存活，而高剂量损伤中Gadd45a基因缺失没有体现出差异。造血重建能力要通过连续移植长期观察Gadd45a基因缺失是否对小鼠造血重建功能有影响，而在一次移植中并没有显现出来。我们推测短期的压力作用下Gadd45a基因缺失造血干细胞DNA损伤修复加强，p38信号通路起主导作用，而长期来看DNA损伤累积，Gadd45a与其他信号分子等相互作用最终是体现功能的下降，有待于进一步研究。Gadd45a基因缺失在放射线损伤后对于骨髓造血干细胞功能的影响，以及其他压力下造血干细胞功能的影响有何不同有也待于进一步研究。Gadd45a基因对于指导临床治疗中，如何防护对放化疗病人造血功能的影响具有重要的意义。

［1］Fan，W.，Richter，G.，Cereseto，A.，Beadling，C.，and Smith，K.A.Cytokine response gene induces p21 and regulates both cell growth and arrest［J］.Oncogene1999，18：6573-6582.

［2］Abdel-Wahab，O.I.，Grubbs，E.，Viglianti，B.L.，Cheng，T.Y.，Ueno，T.，Ko，S.，Rabbani，Z.，Curtis，S.，Pruitt，S.K.，Dewhirst，M.W.，and Tyler，D.S.The role of hyperthermia in regional alkylating agent chemotherapy［J］.Clin Cancer Res2004，10：5919-5929.

［3］Vairapandi，M.，Balliet，A.G.，Fornace，A.J.，Jr.，Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.The differentiation primary response gene MyD118，related to GADD45，encodes for a nuclear protein which interactswith PCNA and p21WAF1/CIP1［J］.Oncogene1996，12：2579-2594.

［4］Kastan，M.B.，Zhan，Q.，el-Deiry，W.S.，Carrier，F.，Jacks，T.，Walsh，W.V.，Plunkett，B.S.，Vogelstein，B.，and Fornace，A.J.，Jr.A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxiatelangiectasia［J］.Cel1 1992，l 71：587-597.

［5］Hollander，M.C.，Sheikh，M.S.，Bulavin，D.V.，Lundgren，K.，Augeri-Henmueller，L.，Shehee，R.，Molinaro，T.A.，Kim，K.E.，Tolosa，E.，Ashwell，J.D.，Rosenberg，M.P.，Zhan，Q.，Fernandez-Salguero，P.M.，Morgan，W.F.，Deng，C.X.，and Fornace，A.J.，Jr.Genomic instability in Gadd45a-deficient mice［J］.Nat Genet1999，23：176-184.

［6］Zhan，Q.，Antinore，M.J.，Wang，X.W.，Carrier，F.，Smith，M.L.，Harris，C.C.，and Fornace，A.J.，Jr.Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin B1 kinase activity by the p53-regulated protein Gadd45［J］.Oncogene1999，18：2892-2900.

［7］Hollander，M.C.，Kovalsky，O.，Salvador，J.M.，Kim，K.E.，Patterson，A.D.，Haines，D.C.，and Fornace，A.J.，Jr.Dimethylbenzanthracene carcinogenesis in Gadd45a-nullmice is associated with decreased DNA repair and increased mutation frequency［J］.Cancer Res 2001，61：2487-2491.

［8］Smith，M.L.，Ford，J.M.，Hollander，M.C.，Bortnick，R.A.，Amundson，S.A.，Seo，Y.R.，Deng，C.X.，Hanawalt，P.C.，and Fornace，A.J.，Jr.p53-mediated DNA repair responses to UV radiation：studies of mouse cells lacking p53，p21，and/or gadd45 genes［J］.Mol Cell Biol 2000，20：3705 -3714.

［9］Harkin，D.P.，Bean，J.M.，Mik los，D.，Song，Y.H.，Truong，V.B.，Englert，C.，Christians，F.C.，Ellisen，L.W.，Maheswaran，S.，Oliner，J.D.，and Haber，D.A.Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1［J］.Cell1999，97：575 -586.

［10］Takekawa，M.，and Saito，H.A family of stress-inducible GADD45-like proteinsmediate activation of the stress-responsive MTK1/MEKK4 MAPKKK［J］.Cell 1998，95：521-530.

［11］Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.Gadd45 modulation of intrinsic and extrinsic stress responses in myeloid cells［J］.Cell Physiol 2009，218：26-31.

［12］Yu，H.，Shen，H.，Yuan，Y.，XuFeng，R.，Hu，X.，Garrison，S.P.，Zhang，L.，Yu，J.，Zambetti，G.P.，and Cheng，T.Deletion of Puma protects hematopoietic stem cells and confers long-term survival in response to high-dose gammairradiation［J］.Blood 2010，115：3472-3480.

［13］Gupta，M.，Gupta，S.K.，Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.Gadd45a and Gadd45b protect hematopoietic cells from UV-induced apoptosis via distinct signaling pathways，including p38 activation and JNK inhibition［J］.Biol Chem2006，281：17552 -17558.

［14］Gupta，M.，Gupta，S.K.，Balliet，A.G.，Hollander，M.C.，Fornace，A.J.，Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.Hematopoietic cells from Gadd45a-and Gadd45b-deficient mice are sensitized to genotoxic-stress-induced apoptosis［J］.Oncogene2005，24：7170-7179.