Exonuclease-1缺失延缓端粒酶缺失小鼠造血微环境的衰老

石桂英，林培容，白 琳，鞠振宇

（1中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021；2北京华信医院，北京 100016）

人类衰老过程中的一个重要表现是各器官再生能力及稳态维持能力的降低，这与衰老过程中成体干细胞功能下降有关［1-3］。细胞微环境的变化可以影响成体干细胞功能［4］，而环境变化会影响再生医学中干细胞移植的应用。目前，衰老过程中干细胞微环境变化的分子机制尚不明确。研究表明，端粒酶基因突变和端粒缩短是人类衰老和骨髓衰竭性疾病发生的重要原因之一［5，6］。端粒酶缺陷小鼠的建立为研究端粒与人类衰老的机制提供了重要的模型动物。Exonuclease-1（Exo-1）是一种核酸外切酶，是DNA损伤修复的关键点基因［7］。前期研究发现Exo-1缺失延长了端粒酶基因缺陷小鼠的寿命［8］。然而，在第三代Terc和Exo-1双基因敲除小鼠（G3 Terc-/-Exo-1-/-）小鼠中，不但小鼠的整体环境是双基因敲除，而且造血干细胞也是双基因敲除。为进一步明确，Exo-1基因敲除对端粒酶缺陷小鼠骨髓造血系统的影响是通过改善造血干细胞微环境来起作用的，我们通过骨髓移植实验，然后分析野生型供体造血干细胞在不同受体微环境中的功能，来研究Exo-1对端粒酶缺失小鼠造血微环境衰老的影响。

1 材料和方法

1.1 Exo-1、Terc双基因敲除小鼠

Exo-1基因敲除小鼠由德国引进，Terc基因敲除小鼠及CD45.1小鼠由美国Jackson Laboratory引进。Exo-1、Terc双基因敲除小鼠本实验室繁育。动物许可证号SCXK（京）2009-0007。

G3 Terc-/-及G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠在3～4月龄时，接受4.5Gy放射线照射，4 h内眼后注射野生型CD45.1小鼠全骨髓细胞，约250μL，含1×107细胞，移植后一周给予抗生素预防感染。

1.2 基因敲除小鼠的基因型鉴定

用2周龄小鼠尾尖碱裂解法提取基因组DNA，PCR鉴定基因型。TERC敲除小鼠鉴定引物为：mTRR：5＇-TTCTGACCACCACCAACTTCAAT-3＇，5PPgK：5＇-G GGGCTGCTAAAGCGCAT-3＇，mTRW tF：5＇-CTAAG CCGGCACTCCTTACAAG-3＇。反应条件：94℃预变性3 m in；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸10 m in。野生型片段为250bp，TERC敲除片段为180 bp。Exo-1敲除小鼠鉴定引物为：Primer A：5＇-CTTCGCTTTATGAAGC AGCC-3＇，Primer B：5＇-AGGAGTAGAAGTGGCGCG AAGG-3＇，Primer C：5＇-AGGAAAGAGTCAGAGTGC TGGC-3＇。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸10 m in。野生型片段为318 bp，Exo-1敲除片段为349 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系20μL（试剂购自宝生物工程有限公司）。

1.3 制备单细胞悬液

移植用骨髓细胞取自2～3月龄CD45.1小鼠。小鼠脱颈椎处死后，无菌条件下，剥离后腿骨肌肉，用冰上预冷的PBS缓冲液冲洗骨髓腔，获得全骨髓细胞，定容至10 m L，50μm滤膜过滤，混匀后，取10 μL细胞，稀释10倍，计数。水平转子离心，1000 rpm，10 m in，弃上清，加适量染色缓冲液，调整至需要浓度。

移植后的受体小鼠在9月龄时安乐死后，剥离后腿骨肌肉，用冰上预冷的PBS缓冲液冲洗骨髓腔，获得全骨髓细胞；胸腺研磨成细胞悬液；脾脏纵切成两半后，一半研磨成细胞悬液，一半用10％福尔马林固定，进行HE染色。上述细胞悬液，50μm滤膜过滤，混匀后，取10μL细胞，稀释10倍，计数。水平转子离心，1000 rpm，10 m in，弃上清，加适量染色缓冲液，调整至108细胞/m L。

1.4 标记抗体

外周血细胞30μL，加入CD4-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PE-Cy7、CD11b-APC、CD8-APC-Cy7混合液，冰上静置30 m in，加1 m L PBS，离心，2600 rpm，5 m in，弃上清，加200μL染色缓冲液重悬细胞，50μm滤膜过滤，备流式分析。

骨髓细胞中髓系染色抗体为B220-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、Gr1-PE-Cy7、CD11c-APC、CD11b-APC-Cy7；B系淋巴细胞染色抗体为IgD-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PE-Cy7、IgM-APC、CD43-Biotin、SA-APC-Cy7。染色时先加入CD43-Biotin，冰上静置30 m in，加1 m L PBS，离心，2600 rpm，5 min，弃上清，再加入其它抗体混合物，冰上静置30 min，加1 m L PBS，离心，2600 rpm，5 min，弃上清，加200μL染色缓冲液重悬细胞，50μm滤膜过滤，备流式分析。

2 结果

2.1 Exo-1缺失改善骨髓造血干细胞的微环境

为研究Exo-1对骨髓微环境的影响，我们分析了骨髓中供体来源的B淋巴细胞和粒细胞，以及B淋巴细胞的发育情况。流式分析结果显示，G3Terc-/-Exo-1-/-小鼠骨髓中供体来源的B220+细胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.04），而CD11b+Gr1+的髓系细胞比例低于G3 Terc-/-小鼠，但差别无显著性（P=0.1216）；对不同发育阶段的B淋巴细胞分析发现，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠骨髓中供体来源的Pre B细胞的比例明显高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.01274），而成熟B细胞的比例明显低于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0004）（见图1）。这说明Exo-1缺失改善了骨髓造血干细胞的微环境，从而使供体来源的野生型小鼠骨髓造血干细胞正常分化。

2.2 Exo-1缺失改善脾脏B细胞发育成熟的微环境

为研究Exo-1对脾脏微环境的影响，我们对受体小鼠中供体来源的脾脏细胞进行分析。流式分析结果显示，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠脾脏中B220+细胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P= 0.001），而CD11b+Gr1+细胞的比例下降，但差异无显著性（P=0.1268）（见图2）。这说明Exo-1缺失改善了脾脏细胞的微环境，从而使野生型小鼠脾脏细胞正常发育成熟。

2.3 Exo-1缺失改善胸腺T细胞生长发育环境

为研究Exo-1对胸腺微环境的影响，我们对受体小鼠中供体来源的胸腺细胞进行了分析。对胸腺细胞计数发现，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠胸腺细胞总数明显高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0024）。对胸腺细胞的流式分析结果显示，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠胸腺中CD4、CD8双阳性细胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0428），见图3。这说明Exo-1缺失改善了胸腺细胞的微环境，从而使T淋巴细胞在胸腺中正常发育分化。

2.4 外周血细胞分析

图2 供体来源的脾脏细胞分析图Fig.2 Analysis of donor derived spleen cells注：A：脾脏中供体来源的B220+细胞及CD11b+细胞流式分析图；B：脾脏中供体来源的CD11b+Gr1+细胞流式分析图；C：脾脏中供体来源的B220+细胞和CD11b+ Gr1+细胞所占比例Note：A：representative FACS plot of B220+cells and CD11b+cells in donor derived splenocyte；B：representative FACS plot of Gr1+cells and CD11b+cells in donor derived splenocyte；C：percentage of donor derived B220+cells and CD11b+Gr1+cells in spleen

外周血中各种细胞的比例反应了骨髓和脾脏的造血能力，以及骨髓造血干细胞的多系分化能力。本研究对小鼠外周血流式分析结果显示，G3 Terc-/-Exo-1-/-受体小鼠外周血中供体来源的B淋巴细胞的比例高于G3 Terc-/-受体小鼠（P= 0.04，见图4）。这说明Exo-1缺失改善造血干细胞的微环境，从而使供体来源野生型小鼠骨髓造血干细胞正常发育分化，维持外周血中各种血细胞比例的稳定。

图3 供体来源的胸腺细胞流式分析图Fig.3 Analysis of donor derived thymus cells注：A：胸腺中供体来源的T淋巴细胞流式分析图；B：胸腺细胞总数；C：胸腺中供体来源的CD4、CD8双阳性细胞所占比例Note：A：representative FACS p lot of CD4+and CD8+T lymphocyte cells in the thymus； B：number of total thymus cells；C：percentage of donor derived CD4，CD8 double positive cells in the thymus

3 讨论

本研究中应用端粒功能障碍引起的衰老小鼠G3 Terc-/-小鼠和G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠为受体，CD45.1小鼠为供体，分离骨髓细胞后，进行骨髓移植。在受体小鼠9月龄时取小鼠骨髓、脾脏、胸腺等组织器官进行分析。结果发现，G3 Terc-/-Exo-14/-小鼠骨髓细胞中供体来源的B220+细胞的发育得到改善，在骨髓细胞中所占比例高于G3 Terc-/-小鼠，而且PreB细胞在B220+细胞中的比例明显升高，可见Exo-1缺失改善了骨髓细胞的环境，延缓了骨髓微环境的衰老，从而使供体来源的骨髓造血干细胞能够正常发育分化（见图1）。对脾脏的分析结果发现，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠脾脏供体来源的B220+细胞的比例显著高于G3 Terc-/-小鼠（P= 0.001），可见Exo-1缺失改善了脾脏细胞环境（见图2）。Exo-1缺失改善环境的作用在胸腺发育中更为明显，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠的胸腺细胞总数明显多于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0024）；从细胞发育来看，G3 Terc-/-小鼠供体来源的CD4、CD8双阳性细胞的比例明显降低，Exo-1缺失改善了这种状况，在G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠中供体来源的双阳性细胞的比例明显升高（见图3）。对外周血的分析也得出同样结果，即G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠外周血中供体来源的B220+细胞明显高于G3 Terc-/-小鼠小鼠（见图4）。综上可见，Exo-1缺失改善了端粒酶缺失小鼠的细胞微环境，延缓了造血系统微环境的衰老，从而使植入的野生型骨髓造血干细胞正常发育分化。

图4 供体来源的外周血细胞分析图Fig.4 Analysis of donor derived peripheral blood cells注：A：外周血中供体来源的B220+细胞及CD11b+细胞流式分析图；B：外周血中供体来源的B220+细胞和CD11b+细胞所占比例Note：A：representative FACS p lot of B220+cells and CD11b+cells in the donor derived peripheral blood；B：percentage of donor derived B220+cells and CD11b+cells in the peripheral blood

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