曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其机制

孙艳侠，王国干，崔小岱，高鑫，孙春荣

曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其机制

孙艳侠，王国干，崔小岱，高鑫，孙春荣

目的:观察曲美他嗪对M株柯萨奇病毒B3(CVB3m)感染的病毒性心肌炎小鼠的保护作用并探讨其可能作用机制。

方法:以CVB3m诱导的病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型为研究对象。201只清洁级近交系4～6周龄雄性Balb/c小鼠随机分成5组。正常对照小鼠20只(正常组);病毒性心肌炎小鼠55只(心肌炎组);喂养曲美他嗪10 mg/(kg·d)的正常小鼠20只(药物对照组);喂养曲美他嗪10 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(低剂量治疗组);喂养曲美他嗪20 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(高剂量治疗组)。观察各组血清中肌钙蛋白I(cTnI)水平、血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的变化以及心肌组织中FasmRNA表达水平的变化。

结果:小鼠感染CVB3m后第7天及第14天，与正常组及药物对照组比较，心肌炎组、低剂量治疗组和高剂量治疗组血清cTnI水平、MDA含量显著升高，SOD含量显著降低，FasmRNA的表达显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。小鼠感染CVB3m后第7天，与心肌炎组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组血清cTnI水平显著降低，MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，与心肌炎组及低剂量组比较，高剂量治疗组SOD含量显著升高，FasmRNA的表达显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。感染CVB3m后第14天，与心肌炎组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组血清cTnI水平、MDA含量显著降低，SOD含量显著升高，FasmRNA的表达显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，与低剂量治疗组比较，高剂量治疗组上述指标变化更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。

结论:曲美他嗪能够减少病毒性心肌炎中心肌细胞的损害。其机制可能与其抗氧化作用以及通过下调FasmRNA水平抑制心肌细胞凋亡有关。

心肌炎;曲美他嗪;氧自由基;凋亡;Fas

(Chinese Circulation Journal，2012，27:224.)

病毒性心肌炎(VMC)是由病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性炎症。最常见的病原是柯萨奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)。近年来病毒性心肌炎的死亡率并没有得到根本改变。因此寻找病毒性心肌炎有效治疗药物已经成为当前病毒性心肌炎防治研究的重要内容。曲美他嗪(trimetazidine)是一种新的促进心肌能量代谢的药物，目前已用于缺血性心脏病的治疗［1］。但曲美他嗪在治疗病毒性心肌炎方面的作用机制并不十分清楚，这方面的基础研究较少。本实验研究曲美他嗪对M株CVB3(CVB3m)病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用及可能的作用机制。

1 材料和方法

材料:①实验动物:2011-06至2011-07选择4～6周龄，体重16～18 g左右，近交系雄性Balb/c小鼠201只(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，二级实验动物，动物合格证号:SCXK(京)2006-0009。本动物实验方案通过中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物福利与伦理审查委员会审查。②病毒:柯萨奇B3亲心肌株病毒(首都儿科研究所提供)。病毒在本实验室经Hela细胞和乳鼠原代培养心肌细胞中传代驯化、滴定。最终使用浓度为 1×103PFU/ml(PFU:空斑形成单位)。③主要试剂与仪器:盐酸曲美他嗪片(商品名:万爽力)，为施维雅(天津)制药有限公司生产，批号:国药准字 H20055465。丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)测试试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，分光光度计(UNICO，UV-2000，中国，上海)。小鼠肌钙蛋白I(cTnI)酶联免疫吸附测定试剂盒(购自RB公司，货号2R607s)，全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，美国)。Trizol(Invitrogen公司，美国)，反转录试剂盒［天根生化科技(北京)有限公司］，SYBR GreenⅠ荧光染料(KAPA Biosystem公司，美国)，引物(上海生工公司合成)，实时定量聚合酶链反应(PCR)仪(ROCHE Light-Cycler480，美国)。

方法:①实验分组及治疗方法:将201只小鼠随机分为5组:正常对照小鼠20只(正常组);病毒性心肌炎小鼠55只(心肌炎组);喂养曲美他嗪 10 mg/(kg·d)的正常小鼠20只(药物对照组);喂养曲美他嗪10 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(低剂量治疗组);喂养曲美他嗪20 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(高剂量治疗组)。心肌炎组，低剂量治疗组，高剂量治疗组腹腔单次接种1×103PFU/ml CVB3m制作病毒性心肌炎小鼠模型，0.4 ml/只;正常组和药物对照组小鼠腹腔注射相同剂量不含病毒的Eagel’s培养液0.4 ml/只。注射病毒当天为第0天，从第3天开始药物对照组和低剂量治疗组开始给予曲美他嗪10 mg/(kg·d)，高剂量治疗组给予曲美他嗪20 mg/(kg·d)，正常组和心肌炎组给予等体积饮用水，灌胃给药，连续用药2周。②标本留取:各组实验小鼠在腹腔注射病毒后，分别于第7天、14天每组分别处死6～9只小鼠，称重后眼球取血，离心后，将血清分装冻存;处死小鼠并留取心脏:将心脏用冰生理盐水洗涤2次，滤纸吸干，切成小块分装投入液氮中冻存，待做荧光定量PCR以及其他检测。③观察指标a:血清中cTnI的含量:免疫吸附测定(ELISA)法检测，按试剂盒说明书。b:血清中超氧化物歧化酶，丙二醛含量:采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活性，采用硫代巴比妥酸法测丙二醛含量。按试剂盒提供的操作流程进行。c:心肌组织Fas mRNA的水平:Real-timePCR法。根据Gen-Bank序列号合成小鼠Fas和内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物序列。Fas引物序列:上游:5'-AGCCATGAAGAGAGGAGAGAGC-3'，下 游:5'-CCTGGAACCTGCTAGTCATTTG-3'。GAPDH 引 物 序 列:上 游:5'-CAACTCCCACTCTTCCACCTTC-3'，下 游:5'-TCTCTTGCTCAGTGTCCTTGCT-3'。采用 Trizol法提取心肌总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所得总RNA的纯度和浓度。用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。以GAPDH为内参，PCR的反应体系为20μl体系，包括 DEPC处理水8.2μl，上、下游引物各 0.4 μl、SYBR GREENⅠ 10μl，cDNA 1 μl。反应条件:95℃ 3 min;95℃ 3 s，60℃ 20 s，72℃ 1 s;40℃ 1 min 45个循环。用2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。结果重复3次。

统计学分析:所有数据进行正态性检验，计数资料用均数±标准差，多组间比较用单因素方差分析，方差齐者采用LSD法，方差不齐者进行Dunnett’s T3检验，显著性检验水准α=0.05。全部资料用SPSS13.0统计软件处理。

2 结果

曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠血清肌钙蛋白I含量的影响:免疫吸附测定结果显示病毒接种后第7天及第14天，与正常组和药物对照组比较，心肌炎组，低剂量治疗组和高剂量治疗组血清cTnI含量显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05);与心肌炎组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组血清cTnI水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与低剂量治疗组比较，高剂量治疗组血清cTnI水平降低更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。图1

图1 各组小鼠血清中肌钙蛋白I水平。与A和C组比较*P＜0.05;与 B组比较△P＜0.05;与 D组比较 ▲P＜0.05。A:正常组(n=5);B:心肌炎组(n=6);C:药物对照组(n=5);D:低剂量治疗组(n=6);E:高剂量治疗组(n=6)

曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛含量的影响:小鼠感染CVB3m后第7天，与正常组和药物对照组比较，心肌炎组，低剂量治疗组和高剂量治疗组血清中超氧化物歧化酶含量有明显下降(P＜0.05)，丙二醛含量明显升高(P＜0.05)，差异均有统计学意义。与心肌炎组及低剂量治疗组比较，高剂量治疗组超氧化物歧化酶含量明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。与心肌炎组比较，高剂量治疗组及低剂量治疗组丙二醛含量明显下降，与低剂量治疗组比较，高剂量治疗组丙二醛含量明显下降更明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)。病毒感染后第14天，与正常组和药物对照组比较，心肌炎组、低剂量治疗组和高剂量治疗组血清中超氧化物歧化酶含量明显下降(P＜0.05)，丙二醛含量明显升高(P＜0.05)，差异均有统计学意义。与心肌炎组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组超氧化物歧化酶含量明显升高(P＜0.05)，丙二醛含量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。与低剂量治疗组比较，高剂量治疗组超氧化物歧化酶含量升高更明显(P＜0.05)，丙二醛含量下降更明显(P＜0.05)，差异均有统计学意义，表1。

曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠心肌组织FasmRNA表达的影响:FasmRNA的荧光定量PCR检测结果显示:小鼠感染CVB3m后第7天及第14天，与正常对照组及药物对照组比较，心肌炎组，低剂量治疗组和高剂量治疗组FasmRNA显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。感染后第7天，与心肌炎组，低剂量治疗组比较，高剂量治疗组FasmRNA的表达有所减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。感染后第14天，与心肌炎组比较，高剂量治疗组和低剂量治疗组FasmRNA的表达较心肌炎组显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。与低剂量治疗组比较，高剂量治疗组使心肌组织中FasmRNA的表达下降更明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。图2

曲美他嗪药物对照组在整体发病情况、血清cTnI、超氧化物歧化酶、丙二醛检测、心肌组织中FasmRNA检测显示:曲美他嗪药物对照组与正常组无明显差异。

表1 曲美他嗪对各组小鼠血清中超氧化物歧化酶、丙二醛含量的影响(±s)

表1 曲美他嗪对各组小鼠血清中超氧化物歧化酶、丙二醛含量的影响(±s)

注:与正常组及药物对照组比较 *P＜0.05;与心肌炎组比较 △P＜0.05;与低剂量治疗组比较 ▲P＜0.01

组别 例数超氧化物歧化酶(U/ml)7 d 14 d丙二醛(nmol/ml)7 d 14 d正常组 5 158.24±5.88 163.38±6.58 4.56±0.64 4.73±0.44心肌炎组 8 119.21±6.59* 134.68±3.29* 10.05±1.32* 8.94±1.16*药物对照组 5 159.36±10.09 160.78±7.24 4.63±1.14 5.03±0.56低剂量治疗组 8 126.41±10.63* 142.75±3.45＊△ 7.90±1.40＊△ 7.32±1.02＊△高剂量治疗组 8 139.29±8.79＊△▲ 149.90±4.38＊△▲ 7.40±0.37＊△▲ 6.31±0.72＊△▲

图2 荧光定量PCR检测小鼠心肌组织中FasmRNA表达变化。与A和C组比较 *P＜0.05;与B组比较△P＜0.05;与 D 组比较▲P＜0.05。A:正常组(n=5);B:心肌炎组(n=6);C:药物对照组(n=5);D:低剂量治疗组(n=6);E:高剂量治疗组(n=6)

3 讨论

病毒性心肌炎是各种病毒感染所致以心肌细胞炎性浸润、变性坏死或间质水肿，伴有明显的心肌代谢障碍和心功能改变的心血管疾病，晚期可进展为扩展型心肌病［2］。研究表明病毒性心肌炎时体内抗氧化酶活性降低，自由基生成增加而清除减少，过氧化应激加重心肌损伤是其重要的发病机制［3，4］。丙二醛是脂质过氧化反应的中间产物，直接反映体内自由基损害。超氧化物歧化酶是体内一种重要的自由基清除酶，自由基的过量产生可使超氧化物歧化酶损耗增加，从而使其体内活性降低。本研究发现，病毒感染各组小鼠血清丙二醛含量明显升高而超氧化物歧化酶活性却相应的降低。曲美他嗪是线粒体酶一长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)抑制剂，具有优化心肌细胞能量代谢作用，使能量代谢在缺血状态下从脂肪的氧化转移到葡萄糖的氧化，使心脏ATP生产效率增加，使心肌细胞内氧自由基产生减少，减轻心肌细胞内酸中毒，稳定缺血、缺氧心肌细胞，保护线粒体、溶酶体，保护心肌细胞，使左心室收缩功能得到显著改善［5，6］。本实验结果显示，使用TMZ保护后血清丙二醛含量较正常组显著降低，超氧化物歧化酶活性明显升高，说明TMZ能降低病毒性心肌炎发病过程中丙二醛的含量，对心肌缺血性损伤提供保护作用。

研究发现，心肌细胞凋亡在病毒性心肌炎发生、发展过程中起重要作用，尤以发病早期心肌细胞凋亡最明显［7，8］。细胞毒T淋巴细胞(CTL)介导的细胞毒作用是病毒性心肌炎心肌细胞损伤的主要原因，Fas途径是CTL致靶细胞损伤的主要途径之一。当激活的细胞毒T淋巴细胞(CTL)经Fas/FasL与靶细胞结合时，便可将凋亡信号转入后者，使靶细胞在数小时内发生凋亡［9］。本研究结果显示病毒感染后心肌组织中FasmRNA水平显著上调。可以证实病毒性心肌炎小鼠心肌组织中存在Fas介导的细胞凋亡。而曲美他嗪干预后，心肌组织中FasmRNA水平显著降低。说明适当剂量的曲美他嗪可以抑制细胞凋亡，其作用机制可能与其抑制Fas表达有关。

病毒感染导致心肌损伤，心肌细胞破坏使cTnI释放进入外周血［10］。本试验中，病毒感染后，小鼠血清cTnI的含量较正常组明显增高，提示有持续的心肌损害。提示:cTnI可以作为CVB3m致病毒性心肌炎的生物标志物。曲美他嗪干预后，cTnI降低显著。表明曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠的心肌有保护作用。曲美他嗪药物对照组与正常组无明显差异。说明曲美他嗪在本实验中对正常动物的心肌细胞，Fas水平无明显调节作用。综上所述，曲美他嗪可能通过抗氧化作用以及对Fas途径的干预，对病毒性心肌炎起保护作用。

［1］ 陈杭，杜永远，樊静.冠心病伴左心室舒张功能不全应用曲美他嗪辅助治疗观察［J］.中国循环杂志，2002，17(06):437-439.

［2］ 杨艳敏，谭慧琼，朱俊.病毒性心肌炎与扩张型心肌病的发病机制及免疫治疗进展［J］.中国循环杂志，2001，16(02):156-157.

［3］ Beck M A.Nutritionally induced oxidative stress:effect on viral disease［J］.Am JClin Nutr，2000，71(6 Suppl):1676S-1681S.

［4］ Hiraoka Y，Kishimoto C，Takada H，et al.Role of oxygen derived free radicals in the pathogenesis of coxsackievirus B3 myocarditis in mice［J］.Cardiovasc Res，1993，27(6):957-961.

［5］ Noutsias M，Pauschinger M，Poller W C，et al.Immunomodulatory treatment strategies in inflammatory cardiomyopathy:current status and future perspectives［J］.Expert Rev Cardiovasc Ther，2004，2(1):37-51.

［6］ Padalko E，Nuyens D，De Palma A，et al.The interferon inducer ampligen［poly(I)-poly(C12U)］ markedly protects mice against coxsackie B3 virus-induced myocarditis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(1):267-274.

［7］ Saraste A，Arola A，Vuorinen T，et al.Cardiomyocyte apoptosis in experimental coxsackievirus B3 myocarditis［J］.Cardiovasc Pathol，2003，12(5):255-262.

［8］ Guan J，Sun X，Liang Y，et al.Atorvastatin attenuates Coxsackie virus B3m-induced viralmyocarditis in mice［J］.JCardiovasc Pharmacol，2010，56(5):540-547.

［9］ Seko Y，Kayagaki N，Seino K，et al.Role of Fas/FasL pathway in the activation of infiltrating cells in murine acute myocarditis caused by Coxsackievirus B3［J］.JAm Coll Cardiol，2002，39(8):1399-1403.

［10］ Ellis C R，Di Salvo T.Myocarditis:basic and clinical aspects.［J］.Cardiol Rev，2007，15(4):170-177.

(编辑:汪碧蓉)

Protective Effect and Mechanism of Trimetazidine on Viral Myocarditis in Mice Model

SUN Yan-xia，WANG Guo-gan，CUIXiao-dai，GAO Xin，SUN Chun-rong.Department of Cardiology，Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital，CAMS and PUMC，Beijing(100037)，China Corresponding Author:WANG Guo-gan，Email:wangguog@263.net

Objective:To observe the protective effect and mechanism of trimetazidine on viralmyocarditis inmicemodel.

Methods:A total of201 malemice were randomly divided into 5 groups.Normal control group，n=20，Myocarditis group，n=55，themyocarditis was induced by Coxsackievirus B3(CVB3);Trimetazidine control group，n=20，the normalmice were fed with trimetazidine 10mg/(kg·d)，Low dose group，n=53，myocarditismice were treated with trimetazidine 10 mg/(kg·d)and High dose group，n=53，myocarditismicewere treated with trimetazidine20mg/(kg·d).Effectof trimetazidine on serum levels of cardiac troponin I(cTnI)，super oxide dismutase(SOD)and maleic dialdehyde(MDA)were examined and Fas mRNA expression in myocardium was analyzed by real-time PCR.

Results:At7 and 14 days after CVB3 infection，compared with Normal control and Trimetazidine control groups，the serum levels of cTnI，MDA and Fas mRNA expression increased，SOD decreased in Myocarditis，Low dose and High dose groups，P＜0.05 respectively.At7 days after infection，compared with Myocarditis group，cTnI and MDA decreased in Low dose and High dose groups，P＜0.05 respectively.Compared with Myocarditis and Low dose groups，SOD increased，Fas mRNA decreased in High dose group，P＜0.05 respectively.At 14 days after infection，compared with Myocarditis group，SOD increased，cTnI，MDA and FasmRNA expression decreased in Low dose and High dose groups，P＜0.05 respectively.

Conclusion:Trimetazidine could decrease themyocardium injury inmyocarditismicemodel，thismight be because of its antioxidant activity and the inhibition of FasmRNA expression.

Myocarditis;Trimetazidine;Oxyradical;Apoptosis;Fas

100037 北京市，北京协和医学院 中国医学科学院 阜外心血管病医院 急重症中心(孙艳侠、王国干、高鑫);首都儿科研究所中心实验室(崔小岱、孙春荣)

孙艳侠 硕士研究生 主要从事心血管内科研究 Email:1sunyanxia@sina.com 通讯作者:王国干 Email:wangguog@263.net

R972.4

A

1000-3614(2012)03-0224-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2012.03.020

2011-10-13)

·基础与实验研究·