低分子量肝素的研究进展

杨明康，李晓燕，钱 捷，黄 磊，蔡 谨，徐志南

(1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014;2.浙江大学化学工程与生物工程系生物工程研究所，浙江杭州310027)

肝素(heparin)是一种葡糖胺聚糖，它广泛存在于动物器官和组织(如小肠黏膜、肺等)中，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能，但长期使用会出现出血和诱导血小板减少等负面影响。低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是20世纪80年代开发出来的新一代肝素类抗凝药物，它是由普通肝素(亦称未分级肝素un－fractionated heparin，UFH)解聚而得。其分子量较低，一般为4 000～7 000。临床上主要用于预防深静脉血栓，治疗不稳定心绞痛和心肌梗死，还可用于血液体外循环和血液透析等。与UFH相比LMWH具有口服易吸收、皮下注射吸收好、生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等特点，在欧洲及北美对LMWH的应用大有取代UFH之势［1］。本文介绍了LMWH的化学结构、作用机制及其应用，并对LMWH制备方法的研究进展进行了综述。

1 LMWH的结构及作用机理

UFH是由六糖或八糖重复单位构成的一簇酸性粘多糖混合物，成线形链状，分子量约3～37 kDa，平均分子量15 kDa，抗Xa因子与抗IIa因子活性比大于1.5。而LMWH则是由UFH通过控制的酶解或化学降解或经分级分离所产生的片段。英国药典规定［2］LMWH的重均分子量一般不得大于8 000，且其中分子量小于8 000的物质至少应超过60%。LMWH的主体结构与UFH相似，都是由D－葡糖胺与葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸交替残基糖链组成，但其末端结构存在着较大的不同，LMWH结构如图1所示:

图1 低分子肝素的结构

UFH和LMWH通过激活抗凝血酶功能而起到抗凝血作用，抗凝血酶功能的激活由沿UFH链分布的独特五糖序列所介导，该五糖序列在UFH链上约占1/3，在LMWH链上仅占1/5左右。五糖单位与抗凝血酶结合改变了酶的构象，致使肝素对凝血酶(FIIa)及其活化X因子(FXa)的抑制作用增大了约1 000倍。UFH与LMWH的主要差别在于其对FIIa和FXa的相对抑制作用不同。LMWH链能直接与抗凝血酶结合，改变抗凝血酶的构象，进而抑制FX的活性;而UFH必须与凝血酶及抗凝血酶同时结合，形成三联体复合物后才能起效，且该复合物的组成较为复杂，需同时含有18个以上的糖基和五糖单元的肝素链才能组成。大多数UFH链的长度至少有18个糖基，而LMWH的链长只有抗凝血酶及凝血酶两者结合时长度的50%。因此UFH的抗FXa与抗FIIa的活性大致相当，而LMWH的抗FXa活性则明显高于其抗FIIa活性［3～5］，抗FXa与抗FIIa活性对UFH和LMWH的抗血栓形成作用都是必需的。

2 LMWH的制备方法

LMWH的制备方法包括:物理分离法、化学降解法和合成法。不同制备方法所得LMWH在分子量和生物活性上存在差异，表现为其药动学特性和抗凝谱有某种程度的差别，在临床上不能相互代替［6］。表1列举了EP7.0和BP2010收载的5种目前临床上使用的LMWH［7］。

表1 EP7.0和BP2010收载的五种LMWH的比较

2.1 物理分离法 物理分离法主要包括有机溶剂沉淀法、超滤法和层析法等。物理分离法只是一种简单的分离过滤方法，由于UFH中低分子片段含量很少(1%～2%)，因此该法制备的LMWH产率较低，不宜大规模生产。但其对UFH原有结构破坏较少，具有保留较高生物活性的优点，常用于结构测定及生物活性的研究。

2.1.1 有机溶剂沉淀法 不同分子量的肝素分子在有机溶剂中的溶解度不同，在同一浓度的有机溶剂中，随着分子量的增大，其溶解度逐渐减小。在低浓度甲醇、乙醇、异丙醇中，UFH大分子不溶解，而较小的LMWH分子溶解度大。使得LMWH随着有机溶剂浓度的增大而沉淀出来，从而分离出LMWH。Lormeau等［8］利用乙醇沉淀UFH，得到平均分子量6 500 D的LMWH，其抗凝效价45 U·mg－1，抗FXa效价为160 U·mg－1，但收率仅有2%。

2.1.2 超滤法 超滤法是采用一定规格的超滤膜进行过滤分离LMWH的方法，因UFH与LMWH分子量有较大差异，因此当大分子量的UFH通过超滤膜时分子被截留，而小分子量的LMWH则可以顺利通过超滤膜，从而达到分离纯化LMWH的目的。

2.1.3 层析法 层析法包括凝胶过滤层析法、亲和层析法和离子交换层析法等。凝胶过滤层析法是一种根据分子筛效应来分离不同分子量大小的LMWH的方法，常用的葡聚糖凝胶有Sephadex G－75，该法常配合其他方法使用［9］。亲和层析法是利用共价键连接有特异配体的层析介质，将能特异结合配体的LMWH进行分离的技术，因其分离纯化都是基于标签进行，后续步骤中对标签的处理问题常成为安全顾虑，因而较少用于工业化生产。离子交换层析法则是通过DEAE－纤维素等阴离子交换剂与UFH上的负电荷离子根据交换时的结合力大小不同而将LMWH从中分离出来。

2.2 化学降解法 化学裂解法生产工艺简单，成本低廉，产品质量易于控制，常用于工业化生产。主要有亚硝酸控制解聚降解法、过氧化氢降解法、β－消除降解法和肝素酶降解法等。使用不同的降解方法所得产品的末端结构不同，导致其生物活性也不尽相同。不同降解法制得LMWH的优缺点见表2。

表2 不同化学降解法优缺点比较

2.2.1 亚硝酸控制解聚降解法 亚硝酸降解法工艺流程简单，是工厂较为常用的一种生产LMWH的方法。在低pH值的条件下，亚硝酸先作用于UFH分子中的N－硫酸葡糖胺单位，脱去HSO4－形成－NH2。－NH2与HNO2发生重氮化反应，在放氮同时糖苷键断裂，电子转移，缩环生成2，5－脱氢甘露糖或脱氢甘露醇。

该解聚过程受温度、pH值、亚硝酸盐的浓度及降解时间的影响较大。LMWH的分子量可由亚硝酸用量、反应时间来检测并控制。亚硝酸在反应液中的浓度越大，产物LMWH的平均分子量越小。亚硝酸浓度过低时解聚不够充分，浓度过高时又会导致UFH在不适宜的位置断裂，使结构发生变化。有研究表明［10］亚硝酸用量可在0.01% ～1.0%范围内调整效果较好，残留亚硝酸盐亦可通过超滤或紫外照射脱除［11］。张丽萍等［12］以UFH为原料，通过单因素试验与二次旋转回归组合试验，研究了亚硝酸降解法制备LMWH的最佳条件，结果在反应时间4 h，温度25℃，左右亚硝酸浓度0.6%，pH 2.6时，得到相对分子质量小于8 000的成分含量为89.95%。

2.2.2 过氧化氢降解法 过氧化氢产生的氧自由基能使UFH分子中非硫酸化糖醛酸的C2和C3之间发生键断裂，进而形成LMWH［13］。反应的温度、pH值和过氧化氢浓度对该法制备LMWH的影响较大。在酸性范围时，产物的分子量随着溶液pH值的增大而降低;但当pH值大于8时，产物的分子量则明显增大，因此在反应的过程中应不断加入盐酸以使反应液的pH值始终维持在5～7。

有报导［14］称可以用抗坏血酸、硫酸铜和3%的过氧化氢对UFH进行降解，但制得的产品中残留铜离子。将乙酸铜替代硫酸铜，并在沉淀之前利用EDTA来络合铜离子，进一步用阳离子交换树脂可较好的除去产品中的铜离子［15］。研究表明［16］采用强阳离子树脂酸化处理UFH，再加入过氧化氢，可以生成硫酸化程度较高的LMWH。此外刘东［17］研究了将过氧化氢降解与亲和色谱相结合的方法来制备LMWH，所得的产品抗Xa效价达到了585 IU·mg－1，是目前市场上现有LMWH产品抗Xa效价的4倍以上。

2.2.3 β－消除降解法 β－消除降解法分为肝素的直接处理和肝素季铵盐的碱处理两部分。肝素中糖醛酸的酯化能够增强α－H原子的酸度，使得在水相或非水相介质当中更易于与亲和基团发生β－消去反应。肝素的季铵盐与烷基卤在有机溶剂中发生酯化反应，生成的肝素酯在碱性条件下进一步水解成LMWH。肝素的季铵盐在氯苯和碱存在下加热反应，生成肝素的苄酯能形成4，5未饱和的糖醛酸［18］。碱水解的反应条件，如反应时间、反应温度、碱的浓度等对该法制得LMWH的平均分子量影响较大。

2.2.4 其他制备LMWH的化学降解法 其他制备LMWH的化学方法还有高碘酸降解、次氯酸降解、γ－照射和硫酸－氯磺酸降解等。其中前三种方法其制备机理和过氧化氢降解的制备机理相似，都是通过产生的氧自由基断裂肝素中非硫酸化糖醛酸的C2和C3之间的键，进而生成LMWH。

Lormeau等［19］利用高碘酸降解法制得分子量为4 800～9 000的LMWH，但其抗Xa活性较低。Diaz VB等［20］采用次氯酸降解法生产的LMWH，产品色泽较好且无重金属污染。该法在一定条件下，产品的分子量与反应时间之间有一定关系，产品分子量符合药典规定时即可加入硫氢化钠终止反应。Jeske W等［21］曾用γ－照射法在实验室制备出LMWH，但尚未见其工业化应用。硫酸－氯磺酸降解法［22］降解机理为葡萄糖胺亚基6位上的羟基被硫酸酯化，使得葡糖胺3位上的羟基被硫酸化。该法制备的LMWH分子量为2 000～9 000，产品硫酸化程度比UFH至少高出20%。

2.3 酶法降解 肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂解酶，目前市售的肝素酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，都是来源于肝素黄杆菌。它们能特异性地断裂肝素链上具有特殊修饰的不同序列，从而产生不同的寡糖片段［23］。肝素酶可断裂己糖胺和糖醛酸之间的键，在非还原末端生成4，5－不饱和艾杜糖醛酸。而在还原末端230～235 nm处的吸收值又与降解产物中的肝素分子量有一定关系，因此可以通过测量230 nm处的吸收度来控制产品质量［24］。

周帅等［25］将肝素黄杆菌固定化后制备LMWH，发现所制得的LMWH分子量较为均一，活性也较好。固定化酶和超滤联用可控制产物的分子量，并实现生产的自动化。由于该制备LMWH过程中每次只降解1个双糖单位，因此制得的产品可以作为测定LMWH的对照品使用。目前，商品肝素酶的唯一来源是肝素黄杆菌，其酶的作用方式是外切型，虽然用此肝素酶进行肝素降解在实验室研究已经成功，但在工业上用于肝素寡糖的制备还不成熟。

2.4 合成法 目前市售肝素类商品，无论物理分离法还是化学降解法制备所得，其原料药都是来源于动物，存在原料药受到污染的可能，因此对研制非动物来源的具有更高安全性能的肝素类药品具有迫切需求。而合成法因为主要是通过基因工程的方法制备，所制得的肝素可以满足医药界对于肝素的两个基本要求，即化学和生物学等效于市面使用的动物来源的肝素，以及不含病毒、蛋白转染因子以及化学污染品等。具有较高的安全性和结构的确定性使得合成法研制肝素类似物将会是研究的趋势。

2011年美国伦斯勒理工学院(RPI)的Linhart.J实验室以及北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC)的刘健教授报道了一种化学酶法合成两种结构确定的超低分子量肝素化合物的方法［26，27］。合成过程模拟了肝素的生物合成途径，多糖的骨架使用糖基转移酶构建，然后硫黄基转移酶对特定的位点进行硫黄化修饰。以亚硝酸降解肝素前体所得的二糖为前体，在KfiA和pmHS2的分步加糖基作用下合成七糖，七糖经过N－去三氟乙酰基和C5异构化将葡萄糖醛酸异构化成艾杜葡萄糖醛酸，最后经2－O－硫黄化、6－O－硫黄化以及3－O－硫黄化修饰后最终产物。这两种超低分子量肝素化合物分别需要10步或12步酶反应得到，其得率远大于化学合成法，分别达到45%和37%。这两种超低分子量肝素具有与Arixtra肝素相当的抗凝血活性以及药代动力学特性。该法涉及多种基因和酶的克隆表达，步骤较复杂，目前尚未见到其正式应用于工业生产的报道，但上述方法为合成肝素类似物提供了一种极具吸引力的新思路。

3 展望

LMWH是一类具有极大市场潜力的抗血栓药物，其在国际医药市场的应用已较成熟，但在国内市场上LMWH的临床应用仍处于起步阶段。随着国内对LMWH药物认识程度的不断深入，LMWH药物的市场需求必将迅猛增长。我国是世界上产肝素最多的国家，所生产的肝素多以原料的形式用于出口，出口的肝素经国外加工制成LMWH或类肝素等产品又返销回国内，这一模式虽为国家创收了外汇，但产品的附加值不高缺乏市场竞争力。因而探寻研制理想分子量及分子量分布的LMWH新方法，制备出符合国际市场标准的产品将具有广阔的发展前景。

［1］ Hish J，Rsschke R.Heparin and low－molecular－weight heparin:the seventh ACCP Conference on antithrombotic and thrombolytic therapy［J］.Chest，2004，126(3S):188S－203S.

［2］ British pharmacopoeia commission.British pharmacopoeia［S］.London:Her Majesty's Stationery office，1994:1335－1338.

［3］ Jeffrey I，Weitz MD.Low－molecular－weight heparins［J］.N Engl J Med，1997，337:688－697.

［4］ Horlocker TT，Heit JA.Low molecular weight heparin［J］.Anesth Analg，1997，85:874－883.

［5］ Hunt D.Low－molecular－weight heparins in clinical practice［J］.South Med J，1998，91:2－9.

［6］ Linhardt RJ，Loganathan D，AI－Hakim A.Oligosaccharide mapping of Low Molecular Weight Heparins:structrue and activity differences［J］.J Med Chem，1990，33:1639－1645.

［7］ 陆益红，赵慧玲，余立，黄晓龙.关于低分子量肝素类药品的审评思考［OL］.［20101115］.http://www.cde.org.cn/dzkw.do id=311935＆method=largePage

［8］ Lormeau JC，Maine MJ，Choay J.Oligosaccharides having anti－Xa activity and pharmaceutical composition containing them:US，4401662［P］.1983－08－30.

［9］ 张倩，乐以伦，万昌秀.低分子量肝素的制备及纯化［J］.四川联合大学学报(工程科学版)，1999，3(2):39－47.

［10］ Barnett WE.Improved anticoagulant substance:WO，8103276［P］.1981－11－26.

［11］ Branellec JF，Espejo J，Picart P.Purified heparin fractions，method for obtaining them and pharmaceutical compositions containing them:US，5599801［P］.1997－02－04.

［12］张丽萍，李雷刚，马中苏.亚硝酸降解法制备低分子肝素(LMWH)的工艺参数优化与确定［J］药物分析杂志.2009，29(7):1148－1151.

［13］Linhardt RJ，Gunay NS.Production and chemical processing of low molecular weight heparins［J］.Semin Thromb Hemost.1999，25(suppl 3):5－16.

［14］Lasker SE.Low molecular weight derivative of heparin that is orally axtive in mice，in Adv.Exp.Med.and Biol.V52" Heparin structure Function and clinical implications"［M］.New York:Plenum press，1975:119－130.

［15］Bianchini P.Process for the preparation of oligosaccharide fractions by degradation of heparin:US，4629699［P］.1986－12－16.

［16］Smith MR.Process for manufacturing low molecular weight heparins by depolymerization of normal heparin:EP，0101141［P］.1984－02－22.

［17］刘东.新型超纯低分子肝素的制备方法研究［D］.苏州:苏州大学，2010.

［18］Uzan A.Sulfated polysaccharides obtained from heparin，preparation process，pharmaceutical composition and use thereof:US，5847921［P］.1998－12－15.

［19］ Lormeau JC，Petitou M，Choay J.Low molecular weight heparins of regular structure，their preparation and biological uses:US，4990502［P］.1991－02－05.

［20］Diaz VB，Domanico RH，Fussi F.Process for controlled depolymerization of polysaccharides:US，4977250［P］.1990－12－11.

［21］Jeske W，Iqbal O，Gonnela S，et，al.Pharmacologic profile of a low molecular weight heparin depolyjmerized by gamma－irradiation，Semin Thromb Hemost［J］.1995，21 (2):201－211.

［22］Naggi A，Torri G.Depolymerized and supersulfated heparin，process for its preparation and pharmaceutical compositions:US，4727063［P］.1988－02－03.

［23］高宁国，程秀兰，杨敬.肝素酶生产菌的筛选及发酵条件［J］.微生物学报，1999，39(1):64－67.

［24］ Linhardt R.J.Analysis of glycosaminoglycans with polysaccharidelyases［M］.New York:Wiley Interscience: 1994，2:17－32.

［25］周帅.透性化肝素黄杆菌的固定化及其降解肝素的研究［D］.山东:山东大学，2009.

［26］Sayaka M，Linhardt RJ.Chemoenzymatic synthesis of the next generation of ultralow MW heparin therapeutics［J］.Future Med Chem，2012，4(6):289－296.

［27］Xu YM，Sayaka M，Majde T，et al.Chemoenzymatic Synthesis of Homogeneous Ultralow Molecular Weight Heparins［J］.Science，2011，334(498):498－500.