HPLC法测定维生素C片含量

蒋江云

(三明市药品检验所，福建三明365000)

维生素C是人体胶原蛋白形成所必需的，它有助于保持结缔组织、骨样组织以及牙本质的完整，维生素C的缺乏可导致齿龈肿胀、出血，皮下淤点等，临床中经常需要给患者进行维生素C补充和治疗。维生素C片收载于《中国药典》2010年版［1］，其含量测定采用碘量法。碘量法测定时在判断滴定终点时可能产生人为的误差，且新版药典中碘滴定液的标定改用硫代硫酸钠反标，增加了移液和判断滴定终点的二重误差。维生素C在含水介质中，由于受光、空气、温度和pH影响，样品溶液不稳定使测定结果不理想。本文以二巯基丙烷磺酸钠(DMPS)62.5 mg·mL－1为抗氧剂［2］，以磷酸盐缓冲液pH(6.0±0.1)为溶剂，可使样品处于初始状态，建立HPLC法测定维生素C的含量。该方法操作简便，专属性强，干扰少，稳定性和重现性好，结果准确。本实验同时用碘量法进行含量测定，对两种方法进行比较，测定结果相近，说明建立的HPLC法可作为维生素C片的含量测定和质量控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司);色谱柱为 Hypersil ODS C18键合硅胶柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);Cary－50紫外可见分光光度计(美国瓦里安); DELTA－320精密pH计(瑞士梅特勒一托利多酸度计); BP211D电子天平(德国赛多利斯);德国BRAND单道可调移液器(规格分别为20～200 μL、500～5 000 μL)。

1.2 试药 维生素C对照品(中检所，批号:100425－200702，含量:100.0%，规格:100 mg，供含量测定用);维生素C片(福建省三明天泰有限公司，规格:100 mg/片，批号20111001，编号01);维生素C片(四川省三星堆制药有限公司，规格:100 mg/片，批号:110402，编号02);维生素C片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，规格:100 mg/片，批号: 100932，编号03);2，3－二巯基丙烷磺酸钠(美国阿法埃莎，纯度:95%);甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司);其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流动相为磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4 g与磷酸二氢钾16 g，加煮沸过的冷水溶解并稀释至2 000 mL，pH调节至6.0±0.1)－甲醇(95∶5);柱温为室温;流速为1.0 mL·min－1;检测波长266 nm;进样量20 μL。

2.2 标准曲线的制备 精密称取维生素C对照品24.58 mg置25 mL棕色容量瓶，加DMPS溶液25 μL，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，得约1 mg·mL－1的标准贮备液，避光保存。精密量取标准贮备液各0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL分置100 mL棕色量瓶，各加入DMPS溶液100 μL，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)稀至刻度，得浓度分别约为5、10、15、20、25、30 μg·mL－1的溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪，(Y)对相应的浓度(X)进行线性回归，从而得到维生素C的标准曲线方程为:Y=99.984 5X－0.004 0(r=1.000 0，n=6)。结果表明维生素C进样量在5～30 μg·mL－1范围内，呈良好的线性关系，符合外标法定量测定的要求。

2.3 供试品溶液的制备 取编号01的供试品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素C 50 mg)置50 mL棕色量瓶，加入DMPS溶液50 μL，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，摇匀，即得约1 mg·mL－1的供试品溶液，滤过;取续滤液2 mL置100 mL棕色量瓶，加入DMPS溶液100 μL，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，摇匀，即得20 μg·mL－1的供试品溶液。

2.4 测定法 分别精密吸取浓度为20 μg·mL－1的对照品溶液、供试品溶液及依比例加入DMPS溶液的磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)20 μL，按上述色谱条件进样分析，理论板数以维生素C的色谱峰计达6 700，符合液相色谱条件，结果见图1。

2.5 精密度试验 精密吸取25 μg·mL－1的标准溶液，连续进样5次，测定维生素C峰面积，结果维生素C峰面积的RSD为0.05%。

图1 高效液相色谱图

2.6 重复性试验 取同一供试品6份(样品编号01)，照2.3项试验，平均含量为标示量的100.39%，其RSD为0.62%。

2.7 稳定性试验 取20 μg·mL－1的标准溶液，在室温条件下分别放置0、1、2、3、4、5、6、7 h后进样测定，结果维生素C峰面积的RSD为0.53%，表明供试品溶液在7 h内稳定。

2.8 加样回收试验 精密量取2.3中已知含量的供试品溶液(1 mg·mL－1)1 mL置100 mL棕色量瓶(样品编号01，规格100 mg·片－1，含量为73.04%，平均片重0.138 3 g，称取0.074 40 g)，共9份，各加入DMPS溶液100 μL，按低、中、高浓度依次加入约1 mg·mL－1的维生素C标准贮备液0.6、1.0、1.4 mL，每个浓度分别配制3份，以磷酸盐缓冲液(pH 6.0± 0.1)为溶剂混合均匀。按“2.1”项下的色谱条件进行测定，通过测得量与加入量的比值来计算加样回收率。结果其平均回收率为99.70%。

表1 回收率试验

2.9 样品含量测定 依正文2.3及药典方法测定三批样品，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=4)(单位:%)

3 讨论

溶剂的选择。维生素C分子中的烯二醇基具有极强的还原性，其水溶液在空气中极不稳定，易被氧化为二酮基而成为去氢抗坏血酸。维生素C水溶液在弱酸性环境中稳定性较好，经选择比较，以磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)为溶剂，加入水溶性抗氧剂二巯基丙烷磺酸钠(DMPS)，其水溶液稳定性提高。如以磷酸盐缓冲液(pH 3.0±0.1)为溶剂，同样加入上述抗氧剂，维生素C水溶液稳定性稍差，且色谱图中出现一个倒吸收的溶剂峰有时会干扰维生素C主峰的自动积分，故不宜选择。以磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)为溶剂，较以流动相为溶剂稳定性又更强。以2.1色谱条件测定，加入抗氧剂的磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)无任何吸收峰，所选择的溶剂对维生素C含量测定无干扰。实验中所配制的磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)组分中分别含0.01 moL·L－1磷酸氢二钾与0.06 moL·L－1磷酸二氢钾，盐含量相对较低，对色谱系统影响小。

测定波长的选择。以磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)为空白，取加入抗氧剂DMPS溶液的磷酸盐缓冲液(pH 6.0± 0.1)在200～400 nm范围内进行扫描，无吸收峰;取维生素C对照品适量，按比例加入适量的DMPS溶液，以磷酸盐缓冲液(pH 6.0±0.1)配成浓度为10 μg·L－1的维生素C溶液，在200～400 nm范围内进行扫描，维生素C在266 nm处有唯一的最大吸收，确定266 nm为本实验的测定波长。

由于维生素C易氧化，配制磷酸盐缓冲液时所用的蒸馏水要煮沸放冷后才能使用;维生素C见光不稳定，须避光操作，用棕色容量瓶和样品瓶，以提高该方法的准确性。与传统的滴定相比，该法灵敏度高、专属性强，可用于维生素C片含量的测定。

［1］ 杭太俊.药物分析［M］.第7版.北京:人民卫生出版社，2011:536.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.