中药补肾方对心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脱氢酶的作用研究①

史文静，周华，戎靖枫，苑春元

中药补肾方对心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脱氢酶的作用研究①

史文静，周华，戎靖枫，苑春元

目的 研究补肾方对心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)的作用。方法60只大鼠随机分为模型组、假手术组、曲美他嗪组、补肾低、中、高剂量组，每组10只。采用结扎冠状动脉前降支法制备心力衰竭大鼠模型，术后2周开始灌胃，分别给予药物干预8周。8周后通过颈动脉插管记录大鼠血流动力学改变，包括左室收缩压(LVSP)、左室舒张压(LVEDP)、左室内压上升下降最大速率(±LVdp/dtmax)；采用分光光度计检测心力衰竭大鼠心肌Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶以及SDH水平。结果模型组大鼠心肌LVSP和+LVdp/dtmax较假手术组明显降低(P＜0.01)，而LVEDP和-LVdp/dtmax明显升高(P＜0.05)；补肾方干预后，中、高剂量大鼠心肌收缩、舒张功能明显优于模型组(P＜0.01)，以高剂量补肾方改善心力衰竭大鼠心功能明显。补肾方干预后，Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力高于模型组，但低于假手术组，且随补肾方剂量增加，Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力逐渐增强。结论补肾方可改善心力衰竭大鼠的心功能，可能与Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶以及SDH活力增强相关。

补肾方；血流动力学；Na+-K+ATP酶；Ca2+-Mg2+ATP酶；琥珀酸脱氢酶；心力衰竭；大鼠

心力衰竭是一种临床综合征，绝大多数情况下是指心肌收缩能力下降，组织、器官灌注不足，导致肺循环和(或)体循环淤血的临床表现。目前，现代医学虽已提出减轻容量负荷、抗心肌重构以及降低心肌氧耗等为基石的标准化治疗方案，但心力衰竭患者的生存率仍较低，5年生存率接近于恶性肿瘤。而中医药治疗心力衰竭有其特点和优势，值得进一步研究。在临床实践中我们发现补肾方(鹿角片、仙灵脾、生黄芪、党参)可以改善心力衰竭患者临床症状。本研究旨在探讨补肾方对心力衰竭大鼠的作用。

1 材料与仪器

1.1 动物分组 清洁级雄性SD大鼠60只，体重250～300 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(沪)2008-0016。动物喂养标准合成饲料，实验前适应性饲养7 d。随机分为：假手术组，模型组，曲美他嗪组，补肾高、中、低剂量组。每组10只。

1.2 药品和试剂

1.2.1 药品 温补肾阳方(上海中医药大学附属曙光医院制剂室提供)为鹿角片、仙灵脾、生黄芪、党参，按 12∶15∶30∶30 组方，将 13.05 kg 生药水煎两次，每次1 h，再加10倍量水混匀，药液过100目不锈钢筛，90℃浓缩为净重8.1 kg、相对密度为1.226浸膏。曲美他嗪(片剂)(施维雅制药有限公司，批准文号：国药准字H20055465)，过100目筛后置于双蒸水，制成1 mg/ml浓度的曲美他嗪混悬液。

1.2.2 试剂 大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶检测试剂盒：南京建成科技有限公司，产品批号：2011126；SDH测试剂盒：南京建成科技有限公司，产品批号：20111229。

1.3 仪器 电子天平：METTLER TOLEDO公司；匀浆机：IKA公司；PowerLab 8/30生物信号处理和分析系统：ADinstruments公司；Agilent 1200 Series HPLC：Agilent公司；IKA-werkeTyp VX2E震荡器：IKA公司；Direct-Q3纯水系统：Millipore公司；分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 模型制备 冠状动脉前降支结扎术略加改进制备心力衰竭大鼠模型[1]。具体步骤如下：取清洁级雄性SD大鼠，术前常规禁食禁水12 h，置于浸有乙醚棉球的密闭容器内麻醉，仰卧位固定在手术台上，暴露胸部手术视野区，常规消毒，于心间搏动最强处稍上(第4、5肋间)与胸骨平行处作一长约2～3 cm的横向切口，钝性分离胸大肌(术中可能存在大鼠因乙醚挥发而清醒，予吸入少量乙醚)，左手持钝头剪紧靠胸骨左缘插入肋间肌，同时扩大胸腔切口，暴露心脏，剪开心包膜，双手挤压胸部，使心脏自行跳出胸腔外，迅速于左冠状动脉前降支起始点下约2 mm处结扎，以钝性剪刀扩大胸腔切口，使心脏回复至胸腔，随即缝合皮肤。术后以标准导联Ⅱ(纸速50 mm/s)心电图ST段弓背抬高为急性心肌梗死形成。假手术组不结扎冠脉，余操作同前。各组于10周时测定大鼠血流动力学，并开胸留取心肌组织于-80℃冰箱储存备用。

2.2 给药方法 术后2周开始灌胃，以假手术组为空白对照组，曲美他嗪为阳性药物对照组，分别予药物干预8周。模型组、假手术组：蒸馏水1.0 ml/kg⋅d灌胃；曲美他嗪组：曲美他嗪混悬液1.0 mg/kg⋅d灌胃；补肾高剂量组17.4 g/kg⋅d；补肾中剂量组8.7 g/kg⋅d；补肾低剂量组4.4 g/kg⋅d。

2.3 血流动力学测定 灌胃结束后大鼠禁食禁水24 h，术前称取大鼠体重，以肝素钠(1200 U/kg)抗凝30 min，用25%乌拉坦(2.0 mg/kg)腹腔麻醉，仰卧位固定于大鼠手术台上，分离右侧颈总动脉，插入链接压力换能器的PE250型聚乙烯心导管，稳定5 min后插入左心室，通过PowerLab8/30型生物信号处理和分析系统记录大鼠左室收缩压(LVSP)、左室舒张压(LVEDP)以及左室内压最大上升下降速率(±LVdp/dtmax)等参数。

2.4 大鼠心肌ATP酶测定 大鼠心肌ATP酶测定包括Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶。左室重量称取后取非梗死区心肌100 mg，-80℃保存。应用分光光度计分别测定心肌中Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活力值，严格按说明书操作。

2.5 大鼠心肌SDH测定 左室重量称取后取非梗死区心肌100 mg，-80℃保存。应用分光光度计分别测定心肌中SDH活力值，严格按说明书操作。

2.6 统计学分析 采用SPSS 19.0分析软件，组间比较采用ANOVA分析，显著性水平α=0.05。

3 结果

假手术组于造模后7 d死亡1只；曲美他嗪组于2周后死亡1只，补肾中、高剂量组各死亡1只，故进入后续实验的大鼠为56只。

3.1 血流动力学 模型组大鼠心肌LVSP和+LVdp/dtmax明显低于假手术组(P＜0.01)，而LVEDP和-LVdp/dtmax明显高于假手术组(P＜0.01)；中、高剂量大鼠心肌收缩、舒张功能明显优于模型组(P＜0.01)，以高剂量补肾方改善心力衰竭大鼠心功能明显。补肾高剂量组LVSP、LVEDP和±LVdp/dtmax与中、低剂量组有显著性差异(P＜0.05)。补肾中剂量组LVSP与低剂量有显著性差异(P＜0.05)，而 LVEDP、±LVdp/dtmax无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 补肾方对心力衰竭大鼠血流动力学的影响

3.2 Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力 大鼠心肌的Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力值，在补肾高、中、低剂量组以及假手术组明显高于模型组(P＜0.01)，补肾高、中、低剂量组则低于假手术组(P＜0.05)；曲美他嗪组明显高于补肾低剂量组(P＜0.01)，而与高剂量无统计学差异(P＞0.05)；补肾高剂量组明显高于中、低剂量组(P＜0.01)，中剂量明显高于低剂量组(P＜0.01)。见表2。

表2 补肾方对心力衰竭大鼠心肌Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力的影响

4 讨论

本课题自拟补肾方，研究“补肾以治心”中药方的作用。方中鹿角温补肝肾、补益精血，临床研究显示，鹿角方改善冠脉血流，增加心肌收缩力，改善心功能[2]；仙灵脾温肾壮阳，可增加冠脉血流，降低缺血心肌损伤，抑制脂肪酸代谢[3-5]，改善心功能；黄芪为补气之要药，有强心、改善心肌重构的作用[6-9]，还可降低心肌以及心肌线粒体氧自由基水平、拮抗心肌再灌注损伤、减轻线粒体钙超载，从而保护心肌、改善心肌收缩功能；党参益气养血，补而不燥，在本方中含“阴中求阳”之意，有强心、改善心肌能量代谢的作用[10-11]。本方诸药强调心肾相交、心本乎肾，以温肾求强心。

血流动力学是评估药物干预对心血管作用的常用方法。LVSP是收缩期左心室压力的最大值，一定程度上反映心肌收缩力；+LVdp/dtmax反映心肌收缩成分的缩短最大速度，反应心肌收缩性能；-LVdp/dtmax反映心肌舒张时心肌纤维延长的最大速度，是评价心室舒张功能的指标之一；LVEDP是临床上常用来估计左室前负荷，可间接反映左室功能。本实验中，模型组大鼠心肌LVSP和+LVdp/dtmax较假手术组明显降低，而LVEDP和-LVdp/dtmax明显升高，提示冠脉结扎术后大鼠心肌收缩、舒张功能明显下降，表明冠脉结扎后心力衰竭模型制备成功。补肾方干预后，中高剂量大鼠心肌收缩、舒张功能接近假手术组和曲美他嗪组大鼠，以高剂量改善心力衰竭大鼠心功能明显。由此，补肾方可以改善心力衰竭大鼠心肌收缩、舒张功能，且随剂量升高，作用逐渐增强。

细胞质中Ca2+浓度的变化是心肌收缩、舒张的决定因素。正常情况下，Ca2+通过于肌质网释放和细胞外流入细胞内，引起心肌收缩；Ca2+通过肌质网、Na+-Ca2+交换体(Na+-Ca2+exchanger,NCX)和肌膜上Ca2+-Mg2+ATP酶摄取，引起心肌舒张。因此，任何引起Ca2+浓度波动的因素必然会引起心肌收缩、舒张的变化。心力衰竭时，由于Ca2+转运、释放、摄取功能障碍，导致心肌细胞收缩和舒张功能失常，加重心力衰竭的发生、发展，而影响Ca2+浓度的因素包括多种酶、离子通道以及线粒体调节。研究表明[12-13]，心肌细胞中Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶和NCX的含量和活性是维持细胞内Ca2+浓度稳定的决定性因素。而NCX主要通过Na+-K+ATP酶以及膜电位形成的电-化学梯度驱动，因此本实验研究Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶的表达水平。补肾方干预后，Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活力高于模型组，但低于假手术组，而高剂量与曲美他嗪大鼠间无明显差异，且随补肾方剂量增加，Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活力逐渐增强。由此，补肾方可通过增加肌浆网中Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶表达水平，改善心力衰竭大鼠心肌收缩、舒张功能，提示“补肾以治心”法可以改善心力衰竭大鼠心功能。

SDH是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，是线粒体的一种标志酶。作为参与三羧酸循环的关键酶，SDH是反映线粒体功能的标志酶之一，其活性是三羧酸循环运行的评价指标。心力衰竭时，SDH活性受抑制，氧化磷酸化电子传递功能障碍，氧化过程受阻，能量无法转化成ATP为心脏所利用，影响心力衰竭的发生、发展和转归。有学者通过心复康口服液对心梗后心衰大鼠的实验研究指出，“益气温阳、活血化瘀”法能提高线粒体呼吸酶复合物活性，尤以琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶最为明显[14-15]。本实验中，补肾阳方干预后，SDH活力明显高于模型组，但低于假手术组，中、高剂量心力衰竭大鼠心肌SDH活力优于曲美他嗪，而随剂量增加，补肾方改善心力衰竭大鼠SDH活力作用越显著。可见，“补肾以治心”法可增加SDH活力，改善心力衰竭大鼠心功能。

综上可见，补肾方改善心力衰竭大鼠心功能的作用可能与增加肌浆网中Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶表达水平，改善SDH活力，从而提高线粒体功能，促进ATP合成相关。

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Effect of Bushen Decoction on Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and Succinate Dehydrogenase in Rats with Heart Failure

SHI Wen-jing,ZHOU Hua,RONG Jing-feng,et al.Department of Cardiology of Shuguang Hospital,Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

ObjectiveTo explore the effect of Bushen decoction on Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and succinate dehydrogenase(SDH)in rats with heart failure.Methods60 heart failure rats were established by ligating left anterial descending coronary artery.They were randomly divided into model group,sham operation group,trimetazidine group,Bushen low-dose group,Bushen middle-dose group and Bushen high-dose group with 10 rats in each group.They were gavaged 2 weeks after modeling for 8 weeks,hemodynamic changes including left ventricular systolic pressure(LVSP),left ventricular diastolic pressure(LVEDP),and the maximum rate left ventricular pressure rised or decreased(±LVdp/dtmax)were recorded as well as the level of Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH through the spectrophotometer.ResultsCompared with the sham operation group,the LVSP and+LVdp/dtmaxof rats in model group decreased(P＜0.05),LVEDP and-LVdp/dtmaxincreased(P＜0.05).After Bushen intervention,contractility and diastolic function of myocardial of rats in middle and high dose group were better than model group(P＜0.01),especially in high dose group.Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH activity were higher in Bushen groups than the model group,but lower than the sham operation group.With the increase of the doses,Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH activity gradually increased.ConclusionBushen decoction can improve the cardiac function of rats with heart failure that may be associated with Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH activity.

Bushen decoction;hemodynamics;Na+-K+ATPase;Ca2+-Mg2+ATPase;succinate dehydrogenase;heart failure;rats

[本文著录格式]史文静，周华，戎靖枫，等.中药补肾方对心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脱氢酶的作用研究[J].中国康复理论与实践,2012,18(6):544-547.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.013

上海市教委创新项目(11ZZ111)。

上海中医药大学附属曙光医院心内科，上海市201203。作者简介：史文静(1984-)，女，河南武陟县人，硕士研究生，主要研究方向：中西医结合防治心血管疾病。通讯作者：周华。

R541.6

A

1006-9771(2012)06-0544-04

2012-04-12

2012-04-25)