瞬时受体电位在PSA灰区前列腺癌组织中的表达及意义

张鑫圣，张 颖，许家香，刘世雄

瞬时受体电位在PSA灰区前列腺癌组织中的表达及意义

张鑫圣1，张 颖2，许家香1，刘世雄1

目的：研究瞬时受体电位（Trp-p8）蛋白及mRNA在PSA灰区前列腺组织中的表达规律，探讨其在前列腺癌早期诊断中的作用。方法：通过免疫组织化学的方法研究了前列腺增生症和前列腺癌标本各20例，采用图文数据成像分析系统判定各组织中Trp-p8蛋白及mRNA的表达强度，分析其差异性。建立RT-PCR定量检测PSA灰区值时前列腺组织中Trp-p8 mRNA的方法，并检测40例前列腺疾病患者血液中Trp-p8 mRNA的表达情况。结果：前列腺增生症中Trp-p8蛋白及mRNA的表达强度较弱，而在前列腺癌组织中Trp-p8蛋白及mRNA均呈不同程度的高强度表达，差异具有统计学意义。结论：Trp-p8在PSA灰区前列腺组织中的表达存在差异，在癌组织中的表达强度高于前列腺增生症组织，这种差异性表达对于早期前列腺癌诊断具有鉴别意义。

Trp-p8 mRNA；前列腺癌；前列腺增生症；免疫组化；RT-PCR

瞬时受体电位p8（transient receptor potential p8,Trp-p8）是Ca2+离子通道家族中的一员，其多肽链与瞬时受体电位家族的钙通道具有同源性而得名。Trp-p8属于TRP蛋白的TRPM亚族,故又被称为TRPM8。有关Trp-p8和前列腺癌关系的研究上个世纪未见报道，近年来研究发现Trp-p8可能是前列腺癌的一个肿瘤标记物，但Trp-p8与前列腺癌关系的深入研究国内外仍少见报道，特别是Trp-p8在灰色区域(PSA 4～10 ng/mL)前列腺组织中表达情况的研究的报道罕见。我们采用免疫组织化学的方法和RT-PCR技术研究了PSA灰区前列腺组织中Trp-p8蛋白及mRNA的表达情况。现报告如下。

1 材料

采用前列腺穿刺活检及经尿道前列腺切除手术的石蜡包埋标本，其中前列腺增生症和前列腺癌标本各20例，均经病理确诊。前列腺疾病病人的血液标本，前列腺增生症组与前列腺癌组各20例，均经术后病理确诊,年龄均大于60岁。其中前列腺增生症组术前PSA 4.7～8.9 ng/mL，平均（6.5±0.2）ng/mL，前列腺癌组术前PSA 5.2～9.9 ng/mL，平均（6.7±0.25）ng/mL。二者比较P＞0.05，无差异。

2 方法

2.1 免疫组化方法

2.1.1 试验试剂 兔抗人Trp-p8单克隆抗体购自上海亚培生物科技有限公司，SP免疫组化试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

2.1.2 组织标本制备 组织标本经福尔马林固定后，脱水、透明、浸蜡包埋，4℃保存，制成厚度4 μm石蜡切片。

2.1.3 H-E染色 切片脱蜡入水后，梯度酒精脱水透明，中性树胶封片。

2.1.4 组织切片免疫组织化学SP法染色 切片脱蜡入水，3%H2O2室温孵育15 min，PBS水洗5 min×3次，95～98℃柠檬酸盐缓冲液微波炉中修复 15 min，自然冷却至室温。擦干切片周围水分，正常封闭血清室温下孵育15 min，擦镜纸擦干，加入一抗工作液，37℃下孵育2 h（0.01 M PBS液代替一抗作阴性对照，其余步骤不变）。PBS漂洗5 min×3次，加入生物素标记的二抗，37℃下孵育15 min。PBS漂洗5 min×3次，加入三抗，37℃下孵育15 min，PBS漂洗5 min×3次。DAB室温下显色，镜下观察控制反应时间，充分冲洗中止反应，苏木素复染。脱水透明，树胶封片。

2.2 RT-PCR方法 取10 mL血液样本，用Trizol试剂盒（上海宝曼生物科技有限公司）提取总RNA,按照TIANScript RTKit cDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司）说明书合成cDNA，起始总RNA样品均为1 μg。参考文献[1]设计Trp-p8的引物如下：上游引物：5̓-GCCCAGTGATGT GGACAGTA-3̓,下游引物：5̓-ATC TCC TCT GCGTTG TCGTT-3̓。PCR反应条件为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，共35个循环，最后72℃10 min结束。产物置于含有核酸染料的10%琼脂糖凝胶中电泳20 min，紫外透射仪下观察结果。

2.3 结果判定 免疫组化实验结果采用图文数据成像分析系统，标本组织中Trp-p8的表达以高倍镜下记数100个上皮细胞或基质细胞的阳性细胞百分率和染色强度为标准。阴性（-）：无染色细胞。弱阳性（±）：阳性细胞数<40%，染色浅淡。阳性（+）：阳性细胞数在40～80%之间，染色强度中等。强阳性（++）：阳性细胞数>80%，染色较深。RT-PCR实验产物置于含有核酸染料的10%琼脂糖凝胶中电泳20 min，紫外透射仪下观察结果。

2.4 统计学处理 Trp-p8 mRNA的相对含量用目的基因与GAPDH吸光值×面积的比值表示。所有数据采用SPSS 10.0统计软件包进行统计，计量资料以均值t标准差(±s)表示，组间比较采用两独立样本的t检验。计数资料以率表示，采用四格表χ2检验，P＜0.05认为具有显著性差异。

3 结果

前列腺增生症中Trp-p8蛋白及mRNA的表达强度较弱，而在前列腺癌组织中Trp-p8蛋白及mRNA均呈不同程度的高强度表达，这种表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。详见表1，图1。

表1 Trp-p8蛋白在和mRNA在不同前列腺组织中的表达

图1 前列腺癌组织中Trp-p8蛋白阳性表达，阳性表达为棕黄色，位于胞浆

4 讨论

前列腺癌是目前欧美国家男性中发病率最高的恶性肿瘤，近10年来我国的发病率呈明显递增趋势，成为老年男性最常见的恶性肿瘤之一。其中，早期前列腺癌检出率的提高功不可没。早期前列腺癌在影像学如磁共振上的改变是不显著的。目前用于临床上前列腺癌筛查的主要指标是PSA（前列腺特异性抗原），但其受诸多因素影响。急性前列腺炎、指检、合并膀胱结石、留置导尿等都能干扰检测值，引起误差。尤其在对前列腺癌的早期筛查时，对于PSA检测值反复处于“灰色区域”(4～10 ng/mL)的患者，是否行前列腺穿刺活检，以及是否需要反复穿刺，以减少漏诊率，一直是困扰临床泌尿外科医师的问题。

Trp-p8存在于正常泌尿生殖器官,在前列腺癌细胞和其他细胞中的过量表达表明Ca2+渗透性也许在不同组织中有不同的作用[2]。除了正常的前列腺上皮细胞外,Trp-p8在一些泌尿生殖组织中也被发现,如睾丸、输精管、阴囊皮肤、尿道上皮等。国外Kiessling等人[3]检测了33位前列腺癌患者,发现他们在正常组织和癌组织中的Trp-p8 mRNA的表达存在着差异。统计学分析证明，Trp-p8的表达在癌变细胞中比正常细胞中要多。Fuessel等[4]根据mRNA的数量研究了Trp-p8的表达和前列腺癌的关系，发现Trp-p8 mRNA在恶性癌组织中要比非恶性组织中明显的高很多。在对恶性与非恶性的前列腺癌组织检测中发现,只有Trp-p8的表达有明显的区别,而其他前列腺癌标记物如PSA，检测没有发现明显的区别。Trp-p8的这种特异性表达特点为前列腺癌的早期诊断提供了新的方向。

图2 Trp-p8 mRNA在前列腺增生症组（1）和前列腺癌组（2）的表达

Trp-p8在PSA灰色区域(4～10 ng/mL)前列腺组织中表达情况的研究的报道罕见。国内王怀鹏等[5]曾就Trp-p8在前列腺癌患者组织中的表达做过研究，发现Trp-p8在前列腺增生症和前列腺癌组织中的表达确实存在差异，但其对“灰区”前列腺良恶性组织中Trp-p8的表达情况未见报道。前列腺癌组织中Trp-p8 mRNA和Trp-p8蛋白的表达强度均高于前列腺增生症组织。这种差异是否可以用作筛查高危前列腺癌患者并通过血液检查明确，以便早期诊断，早期治疗，是值得深入研究的方向。在临床诊断过程中，对于PSA值反复处于“灰区”的患者，通过RT-PCR技术检测患者血清中Trp-p8 mRNA的表达丰度，针对表达丰度较高的患者严密随访，进行多次穿刺活检，可能是将来提高早期前列腺癌的检出率和准确率的一个有益尝试。

Trp-p8在前列腺组织中的表达调控机制目前尚不十分清楚。有研究[6]观察到，在非雄激素依赖型前列腺癌和术前采用抗雄激素新辅助治疗的前列腺癌患者中，Trp-p8 mRNA表达水平明显减少，提示Trp-p8可能接受雄激素的调控，而Trp-p8 mRNA表达水平的减少意味着相关疾病的进一步进展。另有研究发现[7]，Trp-p8在前列腺癌细胞中和其他一些类型的癌细胞中的表达不受调控,推断Trp-p8可能是一种致癌基因。Trp-p8通道的过量表达或失控可能导致细胞内钙离子的增加和内质网中钙离子的过载,这种钙离子平衡的改变可能使癌前期细胞对细胞凋亡更具抗性而使细胞癌变[8]。前列腺癌基因治疗中，下调Trp-p8的表达是否可以控制肿瘤进展，是值得进一步研究的问题。

本研究显示，Trp-p8在PSA“灰区”前列腺疾病患者中表达存在差异。同时，我们在患者血液中可以检测到Trp-p8 mRNA表达丰度的差异，这为我们临床筛查早期前列腺癌提供了新思路，通过血检Trp-p8 mRNA的表达丰度来判定患者罹患前列腺癌成为可能。如此患者可以避免前列腺穿刺活检的痛苦和风险，缩减筛查时间,提高早期诊断率。当然，目前Trp-p8在各种前列腺组织中的表达分布规律尚缺乏大样本实验数据，相应诊断流程和参考数据的建立都尚需时日，这些都是我们需要深入研究的问题。

[1]Yang XR,Lin MJ,McIntosh LS,et al.Functional expression of transient receptor potential melastatin-and vanilloid-related chan⁃nels in pulmonary arterial and aortic smooth muscle[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,290(6)：L1267-76.

[2]Natalia Prevarskaya,Roman Skryma.Ca2+homeostasis in apoptotic resistance of prostate cancer cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,11(3)：1326-1335.

[3]Kiessling A,Fussel S,Schmitz M,et al.Identification of an HLA-A-restricted T-cell epitope derived from the prostate can⁃cer-associated protein Trp-p8 [J].The Prostate，2003,56(4)：270-279.

[4]Fuessel S,Scikert D,Meye A,et al.Multiple tumor marker analy⁃ses(PSA,hK2,PSCA,Trp-p8)in primary prostate cancers using quantitative RT-PCR[J].Int J Oncol,2003,23(1)：221-228.

[5]王怀鹏，杨晓茹，王行环，等.Trp-p8在前列腺组织中的表达及其意义[J].中华医学杂志,2005,85(22)：1571-1573.

[6]Henshall SM,Afar DE,Hiller JH,et al.Survival analysis of ge⁃nome-wide gene expression profiles of prostate cancers identifies new prognostic targets of disease relapse[J].Cancer Res，2003,63(14)：4196-4203.

[7]Barritt G,Rychkov G.TRPs as mechanosensitive channels[J].Na⁃ture(Cell Biol),2005,7(2)：105-107.

[8]Yamamura H,Ugawa S,Ueda T,et al.TRPM8 activation suppress⁃es cellular viability in human melanoma[J].Am J Physiol,2008,295(2)：293-295.

Expression of Trp-p8 in Prostate Cancer Tissues of PSA in Grey District

ZHANG Xin-sheng,ZHANG Ying,XU Jia-xiang,et,al.Department of Urology,Taizhou Central Hospital,Taizhou(318000),China

ObjectiveTo study the expression of Trp-p8 in prostate tissues of PSA in grey district and ex⁃plore the role of early diagnosis on prostate cancer（PC）.MethodsImmunohistochemical assay was applied in the prostate cancer and benign prostatic hyperplasia(BPH)groups,20 specimens in eachgroup.The difference of expression level was judged and analyzed.RT-PCR was applied on 40 blood specimens of PSA in grey district,including 20 PC and 20 BPH.ResultsThe expression of Trp-p8 was weak or nega⁃tive in the benign prostatic hyperplasia group,while appeared to be far more abundant in prostate cancer group,the difference was of statistical significance.ConclusionsThe expression of Trp-p8 in prostate tissues of PSA in grey district is different and higher expression appear in prostate cancer than benign prostatic hyperpla⁃sia tissues.Trp-p8 may play an important role in early diagnosis of prostate cancer.

Trp-p8 mRNA；Prostate cancer；Benign prostatic hyperplasia；Immunohistochemistry；RT-PCR

R737.25

A

1007-6948(2012)03-0241-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.03.007

2009年浙江省台州市科技计划项目（编号090KY36）；2011年浙江省台州市科技计划项目（编号111KY07-5）

浙江省台州市中心医院1.泌尿外科；2.输血科 (台州 318000）

张 颖，E-mail：zhangxs0624@163.com

（收稿：2011-11-18 修回：2012-05-16）

（责任编辑 张亚强）