复合丹参的丝素/胶原支架培养牙周膜成纤维细胞应用效果观察

杜 暘，金 鼎，高秀秋

(辽宁医学院附属第二医院，辽宁锦州121000)

人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的增殖分化是牙周组织再生重建的关键。但是在牙周病损区域HPDLFs细胞相对较少。将体外构建的HPDLFs-细胞支架复合体移植入牙周缺损区是一种重要牙周病治疗方法［1，2］，但尚无满意细胞支架可用。2011年10月～12月，我们将丹参复合在丝素/胶原支架上，得到复合丹参的丝素/胶原支架，并用其体外培养HPDLFs，效果满意。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选临床上12岁左右因正畸拔除的健康前磨牙，家蚕的桑蚕茧。主要试剂:胶原(上海生工生物试剂公司，主要成分为Ⅰ型胶原)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司产品)，DMEM高糖培养基(GIBCO，美国)，胰蛋白酶(Amresco)，细胞培养板(Costar，美国)，抗广谱角蛋白抗体(武汉博士德公司)，抗波形蛋白抗体(Vimentin)，丹参提取物(美晨药业有限公司)。仪器设备:倒置显微镜(日本Olympus)，S-3000N型扫描电镜(Hitachi，日本)，HPll00高效液相色谱仪，CO2恒温培养箱(Thermo，美国)，冷冻干燥机(VIRTIS GENESIS 25 LE型)，超净工作台(国产TDGC-2J-1型)。

1.2 方法

1.2.1 复合丹参的丝素/胶原细胞支架的制备 蚕丝置于98～100℃的含0.1%的Na2CO3溶液中处理30 min，重复3次，晾干后溶解于摩尔比为1∶2∶8的CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶剂中，在(70± 2)℃搅拌溶解，依次进行透析、过滤、浓缩后获得丝素水溶液。按胶原丝素水溶液质量比80∶20混合，添加一定量的戊二醛，充分搅拌，用冷冻干燥机，分别依次于－80℃、－40℃及－20℃冷冻6 h，随后减压干燥，得到胶原/丝素支架。在75%乙醇中灭菌处理后，紫外线照射，晾干。每个支架均匀滴入大约含有20 ng的丹参，再次冻干备用。

1.2.2 复合支架上丹参释放情况的检测 取8块复合丹参的支架、2块直接滴入20 ng丹参的空白支架，分别为观察组和对照组。将其置入转速为100转/min、温度为37℃的转篮进入释放池计时。分别在30 min、1 h、2 h、4 h、24 h、1周、2周、4周吸出培养液作为检测样本，以高效液相色谱法检测丹参的有效成分含量，计算各时点丹参释放量占总释放量的百分比。

1.2.3 HPDLFs的原代培养及鉴定 取正畸拔除的上颌第1前磨牙，用PBS液反复冲洗，无菌条件刮取牙取根中1/3的牙周组织，均匀剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，均匀布在培养瓶底，将此培养瓶倒置放置于CO2培养箱内(37℃、5%CO2、100%湿度)，4 h后翻转，以4 mL含胎牛血清青链霉素的DMEM培养液，CO2培养箱继续静置孵育，每3 d更换培养液1次，倒置相差显微镜下观察，待细胞达到汇合点时，进行消化传代。原代培养传至第4代用于实验。以SABC法检测角蛋白、波形蛋白抗体鉴定细胞来源。

1.2.4 HPDLFs接种及分组 将传代培养第4代HPDLFs用0.25%胰酶消化后稀释至1×106/mL，接种于复合丹参的丝素/胶原细胞支架上。置于37℃、5%CO2孵箱中。静置4 h后，以2.0 mL含胎牛血清青链霉素的DMEM培养液，CO2孵箱中静置孵育，每隔3 d换液1次。

1.2.5 HPDLFs增殖情况及支架结构的观察 取7 d时细胞材料复合物，PBS冲洗，2.5%戊二醛固定，再经过乙醇梯度系列脱水，离子喷射仪喷金，扫描电镜观察。

1.2.6 HPDLFs增殖的检测方法 采用MTT法。取上述方法制取的含丹参与不含丹参的支架各24块，分别置于24孔培养板中，为实验组和对照组。取生长状态良好的贴壁HPDLFs用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为1×104/mL，按上述方法接种于支架材料，分别于第1、7、14和28天取出样本各5块，每mL分别加入5 mg不含血清的DMEM 900 μL及MTT 100 μL继续培养4 h后，吸去培养液，加入二甲基亚砜，振荡30 min直至结晶物充分溶解，于490 nm的波长下测光密度值，每孔测3次，取平均值。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。组间比较采用成组t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组支架上丹参释放情况 观察组的丹参在4 h内就释放了将近50%，24 h内释放掉总量的近60%，1周释放掉总量的近75%，2周时达85%，4周基本释放完全。对照组在24 h时基本释放完全。见表1。

2.2 HPDLFs增殖情况及支架结构 扫描电镜观察可见丝素/胶原支架有良好的多孔状结构。HPDLCs在支架上，伸展充分，贴附牢固。

表1 两组各时间点丹参释放率比较(±s)

表1 两组各时间点丹参释放率比较(±s)

注:与对照组相比，*P＜0.05

0.5 h 2 h 4 h 24 h 72 h 168 h 336 h 672 h对照组 52.1±0.3 78.1±0.5 88.9±0.4 90.6±0.3 94.3±0.组别 丹参释放率(%) 3 95.4±0.2 96.4±0.5 99.2±0.6观察组 20.0±0.5* 30.6±0.4* 49.5±0.3* 62.5±0.5* 70.3±0.3* 75.5±0.2* 85.0±0.2* 95.3±0.3*

2.3 HPDLFs增殖情况 接种后第1、7、14和28天两组光密度值见表2。

表2 两组接种后各时点光密度值比较(±s)

表2 两组接种后各时点光密度值比较(±s)

注:与对照组相比，*P＜0.05

组别 光密度值1 d 7 d 14 d 28 d实验组 0.8±0.4 1.6±0.4* 2.2±0.4* 2.4±0.4*对照组0.7±0.1 1.1±0.1 1.5±0.1 1.7±0.2

3 讨论

丹参是我国传统中药，能够促进牙周组织的再生。有学者观察到用丹参复合的生物膜在诱导牙骨质和牙槽骨的再生方面能有很大的作用［3］。研究表明，丹参具有改善局部组织的微循环的作用，能够增加血液的供应;丹参能够提升局部组织促细胞免疫，保证了局部微环境中各种细胞生长因子的产生，从而起到了影响组织再生和修复细胞再生的作用［4～6］。其机制可能是加速了邻近骨组织中锌的动员以及提高血清锌含量，并通过提高支架内骨化物中锌含量、锌/铜比值来加速组织生长和钙化过程［7］。

丝素胶原复合膜是一种载药膜缓释系统，具有良好的生物相容性［8，9］，且胶原有低免疫原性，是一种天然的具有两性荷电性能的聚氨基酸膜。其本身具有特殊的多孔网状结构，因而具有优良的吸附及缓释功能［10］。本实验制取的复合膜其孔隙率在75%以上［11］有着良好的空间结构，促进了HPDLCs的生长、黏附及增殖且无细胞毒性。

本研究以冻干法复合丝素/胶原作为丹参的控释材料，在4周时仍能检测到丹参的少量释放，而在无控释材料的情况下，丹参24 h内即降解完毕，说明控释材料较大程度地延长了丹参的作用时间，一定程度上控制了有效因子的释放。经MTT实验检测，在第21天内丹参仍能释放出有效浓度，从而促进HPDLFs的增殖。当然，复合材料对丹参的控释过程并不完善，实验过程中发现早期过多过快，释放的量不能与时间配合以满足临床治疗。因此，如何改进材料的控释效应做进一步研究。

［1］Bruc kmann C，Walboomers XF，Matsuzaka K，et al.Periodonta ligament and gingival fibroblast dhesion to dentin-like textured Surfaces［J］.Biomaterials，2005，26(3):39-346.

［2］Nakahara T，Nakamura T，Kobayashi E，et al.1n situ tissue engineening of periodontal tissues by seeding with periodontal ligamentderived cells［J］.Tissue Eng，2004，10(3-4):537-544.

［3］战孝光，崔乃强，李忠廉，等.丹参酮ⅡA对兔胆管成纤维细胞的影响［J］.中国中西医结合外科杂志，2010，16(3):326-330.

［4］周金宝，肇毅，朱海青，等.丹参药膜对胃壁创伤组织PDGF表达的影响［J］.山东中医杂志，2005，24(2):105-106.

［5］许碧莲，吴铁，张新乐，张晓燕.复方丹参促进家兔骨折愈合的骨组织形态计量学评估［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(37):45.

［6］鞠刚，徐卫袁，张亚，等.多孔丝素蛋白/羟基磷灰石复合脂肪间充质干细胞修复兔关节软骨及软骨下骨缺损［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(29):5327-5333.

［7］曹阳，王伯初，迟少萍，等.基于丝素蛋白的药物缓释材料［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(8):422.

［8］胡葵葵，戴育成，袁敬东，等.利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究［J］.江西医学院学报，2005，45(6):28-31.